세포외 매트릭스 하이드로겔을 사용하여 정상 조직 방사선 효과 연구
Summary
이 프로토콜은 생체 조사 후 뮤린 유방 지방 패드의 탈세포화 및 후속 하이드로겔 형성방법을 제시한다.
Abstract
방사선은 삼중 음성 유방암환자를 위한 치료법입니다. 건강한 유방 조직의 세포 외 매트릭스 (ECM)에 대한 방사선의 효과와 1 차종양 부위에서의 국소 재발에 대한 역할은 알려지지 않았습니다. 여기서 우리는 뮤린 유방 지방 패드에서 유래한 ECM 하이드로겔의 탈세포화, 투식, 제조방법을 제시한다. 결과는 탈세포화 과정의 효과에 제시되고, 유변학적 파라미터를 평가되었다. 하이드로겔에 캡슐화된 GFP- 및 루시퍼라제 표지 유방암 세포는 조사된 하이드로겔의 증식증가를 입증하였다. 마지막으로, 남근 컨쥬게이트 염색은 캡슐화된 종양 세포의 세포골격 조직을 시각화하기 위해 사용되었다. 우리의 목표는 종양 세포 행동을 연구하기 위하여 생체 내 유방 조직 환경 및 방사선에 그것의 반응을 모방하는 생체외 연구를 위한 하이드로겔을 제조하는 방법을 제시하는 것입니다.
Introduction
암은 세포사멸을 회피하고 또한 먼 부위로 전이할 수 있는 세포의 과잉 증식을 특징으로한다1. 유방암은 2018년에 추정된 266,000의 새로운 케이스 및 40,000의 죽음과 함께 미국에있는 여성 중 일반적인 양식의 한개입니다 2. 특히 공격적이고 치료하기 어려운 것은 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR), 및 인간 표피 성장 인자(HER2)가 결여된 삼중 음성 유방암(TNBC)이다. 방사선 요법은 일반적으로 유방암에서 요추 절제술 다음 잔여 종양 세포를 제거하는 데 사용되지만, TNBC 환자의 13 %이상은 여전히 1 차적인 종양 부위3에서 재발을 경험합니다.
방사선 요법은 유방 절제술과 동일한 장기 생존을 초래하기 때문에 전이 및 재발을 완화하는 데 효과적인 것으로 알려져 있습니다4. 그러나, 방사선 치료는 면역 손상 설정5,6에서원발성 종양 부위에 국소 재발과 연관되어 있음을 최근에 나타났다. 또한, 방사선이 섬유증7을유도함으로써 정상 조직의 세포외 기질(ECM)을 변화시키는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서, 종양 세포 거동을 지시하는 방사선 유도 ECM 변화의 역할을 이해하는 것이 중요하다.
세포화 된 조직은 질병을 연구하기 위해 시험관내 모델로 사용되어 왔다 8,9. 이들 탈세포화된 조직은 ECM 조성물을 보존하고 생체 내 복합체를 재보존한다. 이러한 탈세포화된 조직 ECM은 세포 성장 및기능(10,11)을연구하는데 사용될 수 있는 재구성된 ECM 하이드로겔을 형성하기 위해 추가로 처리 및 소화될 수 있다. 예를 들어, 탈세포화된 인간 리포아스해적 및 심근 조직에서 유래한 주사용 하이드로겔은 비침습적 조직 공학의 방법으로 사용되었으며, 돼지 폐 조직에서 유래한 하이드로겔은 시험관내 시험법으로 활용되었다. 중간 엽 줄기 세포 부착 및 생존력12,13,14. ECM 속성에 정상적인 조직 방사선 손상의 효과, 그러나, 조사 되지 않았습니다.
ECM으로부터 유래된 하이드로겔은 생체내 현상의 시험관내 연구에 가장 큰 잠재력을 가지고 있다. 콜라겐, 피브린 및 마트리겔을 포함한 여러 가지 다른 물질이 연구되었지만, ECM13의조성물을 종합적으로 재구성하기는 어렵다. ECM 유래 하이드로겔을 사용하는 장점은 ECM이 특정 조직에 필요한 단백질 및 성장 인자를 함유한다는 점입니다(14,15). 요추 절제술 동안 정상 조직의 조사는 ECM에 중요한 변화를 일으키고, ECM 유래 하이드로겔은 시험관내에서 이 효과를 연구하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 질병의 더 복잡하고 정확한 시험관 내 모델로 이어질 수 있습니다.
본 연구에서, 우리는 유방 유방 지방 패드 (MFPs)를 방사선 엑보에 실시하였다. MFPs를 탈세포화하고 프리겔 용액으로 만들었습니다. 하이드로겔은 내장된 4T1 세포, 뮤린 TNBC 세포주로 형성되었다. 하이드로겔 물질의 유변학적 특성을 조사하고, 종양 세포 역학을 하이드로겔 내에서 평가하였다. 조사된 MF에서 제조된 하이드로겔은 종양 세포 증식을 강화시켰다. 미래 연구 결과는 치료 다음 암 재발의 맥락에서 세포 세포 상호 작용을 공부하기 위하여 그밖 세포 모형을 통합할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
하이드로 겔 형성의이 방법은 시작 조직의 양에 크게 의존한다. 뮤린 MPS는 작고, 탈세포화 공정은 물질의 현저한감소를 초래한다(표 1). 이 프로세스는 최종 수율을 높이기 위해 더 많은 MF로 반복될 수 있습니다. 밀링은 재료의 손실로 이어질 수있는 또 다른 중요한 단계입니다. 다른 사람들은 극저온 밀로 성공을 보였지만,이 프로토콜은 유봉 부착8,<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 GFP- 및 루시퍼라제-4T1 세포를 제공한 로라 L. 브론사트 박사에게 감사드리며, 에드워드 L. 라고리 박사는 1-(4-(실릴라조)-아조(2-naphthol 염색) -2-나프톨 염색, IVIS 및 라이오필러 사용에 대한 크레이그 L. 듀발 박사, 그리고 박사 에 대한 조언을 구해주었습니다. 사용. 이 연구는 NIH 교부금 #R00CA201304 의해 재정적으로 지원되었습니다.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | – |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | – |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | – |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | – |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | – |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | – |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | – |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | – |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | – |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | – |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | – |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | – |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | – |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | – |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | – |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | – |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | – |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | – |
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