Studere normal tissue stråling virkninger benytter ekstracellulære matrise Hydrogeler
Summary
Denne protokollen presenterer en metode for decellularization og påfølgende hydrogel dannelse av murine bryst fett pads etter ex vivo bestråling.
Abstract
Stråling er en terapi for pasienter med trippel negativ brystkreft. Effekten av stråling på ekstracellulære matrise (ECM) av sunne brystvevet og dens rolle i lokale gjentakelse på den primære tumor området er ukjent. Her presenterer vi en metode for decellularization, lyophilization og fabrikasjon av ECM-hydrogeler avledet fra murine melkefett pads. Resultatene er presentert på effektiviteten av decellularization prosessen, og reologiske parametre ble vurdert. GFP-og luciferase-merket brystkreftceller innkapslet i hydrogeler demonstrerte en økning i spredning i bestrålt hydrogeler. Til slutt, phalloidin bøye farging ble brukt til å visualisere cytoskeleton organisering av innkapslet tumorceller. Vårt mål er å presentere en metode for fabrikere hydrogeler for in vitro studie som etterligner in vivo brystvevet miljø og dens reaksjon på stråling for å studere tumor celle atferd.
Introduction
Kreft er preget av overflødig spredning av celler som kan unngå apoptose og også metastase til fjerntliggende områder1. Brystkreft er en av de vanligste formene blant kvinner i USA, med anslagsvis 266 000 nye tilfeller og 40 000 dødsfall i 20182. En spesielt aggressiv og vanskelig å behandle under type er trippel negativ brystkreft (TNBC), som mangler østrogen reseptor (ER), progesteron reseptor (PR), og menneskelig epidermal vekstfaktor (HER2). Strålebehandling er vanligvis brukt i brystkreft å eliminere gjenværende tumorceller etter lumpectomy, men over 13% av TNBC pasienter fortsatt oppleve gjentakelse på den primære tumor området3.
Det er kjent at strålebehandling er effektiv i begrensende metastasering og gjentakelse fordi kombinasjonen av lumpectomy og stråling resulterer i samme langsiktige overlevelse som mastektomi4. Men det har nylig blitt vist at strålebehandling er forbundet med lokale tilbakefall til den primære tumor området i immunsupprimerte innstillinger5,6. Dessuten er det velkjent at stråling endrer ekstracellulære matrise (ECM) av normalt vev ved å indusere fibrose7. Derfor er det viktig å forstå rollen til stråling-indusert ECM endringer i dikterer tumor celle atferd.
Decellularized vev har blitt brukt som in vitro-modeller for å studere sykdom8,9. Disse decellularized vev bevarer ECM-sammensetning og recapitulate komplekset in vivo ECM. Denne decellularized tissue ECM kan videre behandles og fordøyd å danne rekonstituert ECM hydrogeler som kan brukes til å studere cellevekst og funksjon10,11. For eksempel, injiserbare hydrogeler avledet fra decellularized menneskelige liposaspiratet og fra hjerteinfarkt vev fungert som ikke-invasiv metoder for vev engineering, og en hydrogel avledet fra svin lunge vev ble utnyttet som en in vitro metode for testing mesenchymal Stem Cell vedlegg og levedyktighet12,13,14. Effekten av normal vevs stråling skade på ECM-egenskaper, men har ikke blitt undersøkt.
Hydrogeler avledet fra ECM har størst potensial for in vitro studie av in vivo fenomener. Flere andre materialer har blitt studert, inkludert kollagen, fibrin og matrigel, men det er vanskelig å syntetisk recapitulate sammensetningen av ECM13. En fordel med å bruke ECM-avledet hydrogeler er at ECM inneholder de nødvendige proteiner og vekstfaktorer for en bestemt vev14,15. Bestråling av normalt vev under lumpectomy forårsaker betydelige endringer i ECM, og ECM-avledet hydrogeler kan brukes til å studere denne effekten in vitro. Denne metoden kan føre til mer komplekse og mer nøyaktige in vitro modeller av sykdom.
I denne studien har vi utsatt murine bryst fett pads (MFP-er) til stråling ex vivo. MFP-er ble decellularized og laget i pre-gel-løsning. Hydrogeler ble dannet med innebygde 4T1 celler, en murine TNBC cellelinje. De reologiske egenskapene til det hydrogel materialet ble undersøkt, og tumor celle dynamikk ble evaluert i hydrogeler. Hydrogeler fabrikkert fra bestrålt MFP-er forbedret tumor celle spredning. Fremtidige studier vil innlemme andre celletyper for å studere celle-celle interaksjoner i sammenheng med kreft gjentakelse etter behandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne metoden for hydrogel formasjon er i stor grad avhengig av mengden av starter vev. Murine MFP-er er små, og decellularization prosessen resulterer i en betydelig reduksjon av materiale (tabell 1). Prosessen kan gjentas med flere MFP-er for å øke den endelige avkastningen. Fresing er et annet viktig skritt som kan føre til tap av materiale. Andre har vist suksess med en kryogene mill, men denne protokollen er basert på fresing via en håndholdt mørtel og elektrisk drill med en morter vedlegg<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Laura L. Bronsart for å gi GFP-og luciferase-4T1 celler, Dr. Edward L. LaGory for råd om 1-([4-(Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol farging, Dr. Craig L. Duvall for IVIS og lyophilizer bruk, og Dr. Scott A. Guelcher for rheometer Bruke. Denne forskningen ble økonomisk støttet av NIH stipend #R00CA201304.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | – |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | – |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | – |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | – |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | – |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | – |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | – |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | – |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | – |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | – |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | – |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | – |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | – |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | – |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | – |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | – |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | – |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | – |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
- Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
- Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
- Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
- Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
- Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
- Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
- Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
- Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
- Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
- Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).
