Studera normal vävnad strålningseffekter med hjälp av extracellulära matrix hydrogels
Summary
Detta protokoll presenterar en metod för decellularization och efterföljande hydrogel bildandet av murina mjölkfett kuddar efter ex vivo bestrålning.
Abstract
Strålning är en terapi för patienter med trefaldig negativ bröstcancer. Effekten av strålning på den extracellulära matrisen (ECM) av friska bröstvävnad och dess roll i lokala recidiv på den primära tumör platsen är okända. Här presenterar vi en metod för decellularization, frystorkat, och tillverkning av ECM hydrogeler härrör från murina bröst fett kuddar. Resultaten presenteras på effektiviteten i decellularization processen, och rheologiska parametrar bedömdes. GFP-och luciferase-märkta bröstcancerceller inkapslade i hydrogeler visade en ökning av spridningen i bestrålade hydrogeler. Slutligen, phalloidin konjugatfärgning var anställd för att visualisera cytoskelettet organisation av inkapslade tumörceller. Vårt mål är att presentera en metod för fabricera hydrogeler för in vitro-studie som efterliknar in vivo bröstvävnad miljö och dess svar på strålning för att studera tumör cell beteende.
Introduction
Cancer kännetecknas av överskott proliferation av celler som kan kringgå apoptos och även metastasera till avlägsna platser1. Bröstcancer är en av de vanligaste formerna bland kvinnor i USA, med uppskattningsvis 266 000 nya fall och 40 000 dödsfall i 20182. En särskilt aggressiv och svår att behandla subtyp är Triple negativ bröstcancer (TNBC), som saknar östrogen receptor (ER), progesteron receptor (PR), och Human Epidermal tillväxtfaktor (HER2). Strålbehandling används ofta i bröstcancer för att eliminera kvarvarande tumörceller efter lumpectomy, men över 13% av TNBC patienter fortfarande uppleva återfall på den primära tumör plats3.
Det är känt att strålbehandling är effektivt för att lindra metastaser och recidiv eftersom kombinationen av lumpectomy och strålning resulterar i samma långsiktiga överlevnad som mastektomi4. Emellertid, det har nyligen visat att strålbehandling är förknippad med lokala recidiv till den primära tumör platsen i immunkomprometterade inställningar5,6. Dessutom är det välkänt att strålningen förändrar den extracellulära matrisen (ECM) av normal vävnad genom att framkalla fibros7. Därför är det viktigt att förstå den roll som strålning-inducerad ECM förändringar i diktera tumör cell beteende.
Decellularized vävnader har använts som in vitro-modeller för att studera sjukdom8,9. Dessa decellularized vävnader bevara ECM sammansättning och recapitulate komplexet in vivo ECM. Denna decellularized vävnad ECM kan bearbetas ytterligare och smälta att bilda rekonstituerade ECM hydrogeler som kan användas för att studera celltillväxt och funktion10,11. Till exempel, injicerbara hydrogeler härrör från decellularized humant lipoaspirate och från myokardvävnad fungerat som icke-invasiva metoder för vävnadsteknik, och en hydrogel som härrör från svin lungvävnad utnyttjades som en in vitro-metod för testning mesenkymala stamcells fäste och bärkraft12,13,14. Effekten av normala vävnads strålningsskador på ECM-egenskaper har dock inte undersökts.
Hydrogels härledda från ECM har störst potential för in vitro-studier av in vivo fenomen. Flera andra material har studerats, inklusive kollagen, fibrin, och matrigel, men det är svårt att syntetiskt recapitulate sammansättningen av ECM13. En fördel med att använda ECM-härledda hydrogeler är att ECM innehåller nödvändiga proteiner och tillväxtfaktorer för en viss vävnad14,15. Bestrålning av normal vävnad under lumpectomy orsakar betydande förändringar i ECM, och ECM-härledda hydrogeler kan användas för att studera denna effekt in vitro-. Denna metod kan leda till mer komplexa och mer exakta in vitro-modeller av sjukdom.
I denna studie, vi utsattes murina bröst fett kuddar (MFP) till strålning ex vivo. Multifunktionsskrivare var decellularized och göras till pre-gel lösning. Hydrogels bildades med inbäddade 4T1-celler, en murin TNBC-celllinje. Hydrogelmaterialets reologiska egenskaper undersöktes, och tumörcelldynamiken utvärderades i hydrogeler. Hydrogels tillverkade av bestrålade multifunktionsskrivare förstärkt tumör cell spridning. Framtida studier kommer att omfatta andra celltyper för att studera cell-cell interaktioner i samband med canceråterfall efter behandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna metod för hydrogel bildas är till stor del beroende på mängden start vävnad. Murina multifunktionsskrivare är små, och decellularization processen resulterar i en betydande minskning av material (tabell 1). Processen kan upprepas med fler multifunktionsskrivare för att öka den slutliga avkastningen. Fräsning är ett annat viktigt steg som kan leda till förlust av material. Andra har visat framgång med en kryogen kvarn, men detta protokoll är baserat på fräsning via en handhållen mur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Dr Laura L. Bronsart för att tillhandahålla GFP-och luciferase-4T1 celler, Dr Edward l. lagory för råd om 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo)- -2-Naphthol färgning, Dr. Craig l. Duvall för Ivis och lyophilizer bruk och Dr. Scott A. guelcher för skjuvreometer Använda. Denna forskning stöddes ekonomiskt av NIH Grant #R00CA201304.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | – |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | – |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | – |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | – |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | – |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | – |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | – |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | – |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | – |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | – |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | – |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | – |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | – |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | – |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | – |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | – |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | – |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | – |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
- Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
- Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
- Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
- Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
- Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
- Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
- Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
- Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
- Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
- Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).
