Ekstrasellüler matris Hidrogeller kullanarak normal doku radyasyon etkileri eğitim
Summary
Bu protokol, deselülarizasyon ve ex vivo ışınlama sonrasında murine meme Yağ pedleri sonraki hidrojel oluşumu için bir yöntem sunar.
Abstract
Radyasyon Üçlü negatif meme kanseri olan hastalar için bir terapidir. Radyasyon, sağlıklı meme dokusu ve primer tümör bölgesinde lokal nüks rolündeki rol dışı matris (ECM) üzerinde etkisi bilinmiyor. Burada, duvar meme yağlı pedlerden elde edilen ECM hidrojellerin deselülarizasyon, lyophilization ve imalatı için bir yöntem sunuyoruz. Bulgular deselülarizasyon sürecinin etkinliğinde sunulmuştur ve reolojik parametreler değerlendirildi. GFP-ve luciferase-etiketli meme kanseri hücreleri hydrojels içinde kapsüllenmiş hidrojellerin proliferasyon bir artış göstermiştir. Son olarak, phalloidin Konjugat boyama kapsüllenmiş tümör hücrelerinin siterit organizasyonu görselleştirmek için kullanıldı. Hedefimiz, tümör hücresi davranışlarını incelemek için in vivo meme dokusu ortamını ve radyasyona olan tepkisini taklit eden in vitro çalışma için Hidrojeller üretebilmek için bir yöntem sunmadır.
Introduction
Kanser apoptozis kaçınmak ve aynı zamanda uzak sitelere metastaz hücrelerin aşırı proliferasyon ile karakterize1. Meme kanseri ABD ‘de kadınlar arasında en yaygın formlardan biridir, tahmini 266.000 yeni vaka ve 40.000 ölüm ile 20182. Özellikle agresif ve alt türü tedavi etmek zor üçlü negatif meme kanseri olduğunu (TNBC), hangi östrojen reseptörü yoksun (ER), progesteron reseptör (PR), ve insan epidermal büyüme faktörü (HER2). Radyasyon terapisi, lumpektomi sonrasında kalan tümör hücrelerini ortadan kaldırmak için meme kanserinde yaygın olarak kullanılır, ancak TNBC hastalarının% 13 ‘ ünden fazlası primer tümör bölgesinde nüks deneyimi yaşıyor3.
Lumpektomi ve radyasyon kombinasyonu mastektomi olarak aynı uzun vadeli hayatta kalma nedeniyle radyasyon tedavisinin metastaz ve nüks azaltıcı etkili olduğu bilinmektedir4. Bununla birlikte, son zamanlarda radyasyon tedavisinin, immünoterapi sağlayan ayarlarda primer tümör sitesine yerel nüks ile ilişkili olduğu gösterildi5,6. Ayrıca, radyasyon fibrozis inducing tarafından normal doku (ECM) ekstrasellüler matris değiştirir bilinmektedir7. Bu nedenle, tümör hücresi davranışlarını dikte ederek radyasyona bağlı ECM değişikliklerinin rolünü anlamak önemlidir.
Deselülarize dokularda hastalık8,9çalışma in vitro modelleri olarak kullanılmıştır. Bu deselülarized dokular ECM bileşimi korumak ve Complex in vivo ECM reapitulate. Bu deselülarize edilen doku ECM ‘si, hücre büyümesini ve fonksiyonunu incelemek için kullanılabilecek yeniden oluşturulmuş ECM Hidrojeller oluşturmak için daha fazla işlenmiş ve sindirilebilir10,11. Örneğin, deselülarized insan lipoaspirate ve miyokard dokusundan elde edilen enjekte edilebilir hidrogeller, non-invaziv doku mühendisliği yöntemleri olarak hizmet vermiştir ve bir in vitro test yöntemi olarak domuz akciğer dokusundan elde edilen bir hidrojel kullanılmıştır mezenkimal kök hücre ataşmanı ve canlılığı12,13,14. Ancak, normal doku radyasyon hasarının ECM özelliklerine etkisi araştırılmamıştır.
ECM ‘den elde edilen Hidrojeller, in vivo fenomenlerin in vitro çalışması için en büyük potansiyele sahiptir. Kollajen, fibrin ve matrigel de dahil olmak üzere birçok başka malzeme incelenmiştir, ancak ECM13‘ ün bileşimi için sentetik olarak reapitleştirmek zordur. ECM ‘nin türevi hidrojellerin kullanmanın bir avantajı ECM ‘nin belirli bir doku için gerekli proteinleri ve büyüme faktörlerini içerdiğinden14,15. Lumpektomi sırasında normal dokuların ışınlanması ECM ‘de önemli değişikliklere neden olur ve ECM-türevi Hidrojeller bu etkiyi içinde vitro olarak incelemek için kullanılabilir. Bu yöntem, hastalığın daha karmaşık ve daha doğru in vitro modellerinde yol açabilir.
Bu çalışmada, duvar meme yağ yastıkları (MFP) radyasyon ex vivo maruz. MFP ‘ler deselülarize edilmiş ve ön jel çözeltisi halinde yapılmıştır. Hydrogels Embedded 4T1 hücreler, bir murine TNBC hücre hattı ile kuruldu. Hidrojel materyalinin reolojik özellikleri incelenmiştir ve tümör hücre dinamikleri Hidrojeller içinde değerlendirildi. Radyasyon radyal MFPs gelişmiş tümör hücre proliferasyon imal. Gelecekteki çalışmalar, tedavi sonrasında Kanser nüks bağlamında hücre-hücre etkileşimlerini incelemek için diğer hücre türlerini dahil edecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hidrojel oluşumu bu yöntem büyük ölçüde başlangıç dokusu miktarına bağlıdır. Murine MFP ‘ler küçüktür ve deselülarizasyon süreci malzemenin önemli ölçüde azalmasına neden olur (Tablo 1). Son verimi artırmak için daha fazla MFP ile işlem tekrarlanabilir. Frezeleme, malzemenin kaybına yol açabilecek bir başka önemli adımdır. Diğerleri bir kriyojenik değirmen ile başarı göstermiştir, ancak bu protokol bir el harç ve bir havaneli eki ile elektrikli matkap ile frezelem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Gfp-ve luciferase-4t1 hücreleri sağlamak için Dr. Laura L. Bronsart teşekkür ederiz, Dr. Edward L. lagory 1 üzerinde tavsiye için-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol boyama, Dr. Craig L. Duvall Ivis ve kurutucu kullanımı için, ve Dr. Scott A. guelcher Reometre için Kullanın. Bu araştırma NıH Grant #R00CA201304 tarafından mali olarak destekleniyordu.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | – |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | – |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | – |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | – |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | – |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | – |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | – |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | – |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | – |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | – |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | – |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | – |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | – |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | – |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | – |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | – |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | – |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | – |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
- Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
- Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
- Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
- Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
- Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
- Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
- Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
- Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
- Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
- Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).
