تحديد مستقبلات أوريكسين وإندوكانابينويد في أسماك حمار وحشي للبالغين باستخدام المناعية وطريقة الفلور المناعي
Summary
وترد هنا بروتوكولات للتوصيف المناعي وتوطين الببتيد أوريكسين، مستقبلات أوريكسين، ومستقبلات إندوكانابينويد في الأمعاء وأدمغة من السمنة الطبيعية والناجمة عن النظام الغذائي (DIO) نماذج حمار وحشي الكبار باستخدام المناعية ومزدوج وسائل الفلور المناعي.
Abstract
الكيمياء المناعية (IHC) هي تقنية حساسة للغاية ومحددة تشارك في الكشف عن المستضدات المستهدفة في أقسام الأنسجة مع الأجسام المضادة المسماة. وهي عملية متعددة الخطوات حيث التحسين من كل خطوة أمر بالغ الأهمية للحصول على إشارة محددة الأمثل. ومن خلال IHC، يمكن الكشف عن توزيع وتوطين المؤشرات الحيوية المحددة، مما يكشف عن معلومات عن الحفظ التطوري. وعلاوة على ذلك، يسمح IHC لفهم التعبير وتوزيع التغيرات من المؤشرات الحيوية في الحالات المرضية، مثل السمنة. IHC، أساسا تقنية الفلور المناعي، يمكن استخدامها في حمار وحشي الكبار للكشف عن تنظيم وتوزيع الجزيئات المحفوظة في الحساسية، ولكن بروتوكول IHC القياسية ليست estasblished. أوريكسين وإندوكانابينويد هما نظامان مُحافظان بشدة على التحكم في تناول الطعام وأمراض السمنة. ذكرت هنا هي بروتوكولات تستخدم للحصول على معلومات حول الببتيد أوريكسين (OXA), مستقبلات أوريكسين (OX-2R), ومستقبلات القنب (CB1R) توطين وتوزيع في الأمعاء والدماغ من نماذج أسماك حمار وحشي الكبار الطبيعية والناجمة عن النظام الغذائي (DIO). كما تم وصف طرق للمناعة ومزدوج الفلور المناعي، فضلا عن إعداد الكواشف، والتثبيت، وتضمين البارافين، والحماية بالتبريد من أنسجة حمار وحشي والاستعداد لخطوة حجب النشاط الذاتية والخلفية مكافحة البقع. يتم الحصول على مجموعة كاملة من المعلمات من التجارب IHC السابقة، والتي من خلالها أظهرنا كيف يمكن أن يساعد الفلور المناعي في فهم OXs، OX-2R، وتوزيع CB1R، وتوطين، والحفاظ على التعبير في أسماك حمار وحشي للبالغين الانسجه. الصور الناتجة مع كثافة إشارة محددة للغاية أدى إلى تأكيد أن حمار وحشي هي نماذج الحيوانات المناسبة للدراسات المناعية الكيميائية للتوزيع، وتوطين، والحفاظ التطوري للعلامات الحيوية محددة في الظروف الفسيولوجية والمرضية. البروتوكولات المعروضة هنا ينصح لتجارب IHC في حمار وحشي الكبار.
Introduction
المناعية هي (IHC) هو أسلوب كلاسيكي راسخة تستخدم لتحديد مكونات الخلوية أو الأنسجة (المستضدات) عن طريق تفاعل الأجسام المضادة المستضد1،2. ويمكن استخدامه لتحديد توطين وتوزيع الجزيئات الحيوية المستهدفة داخل الأنسجة. IHC يستخدم التفاعلات المناعية والكيميائية للكشف عن المستضدات في أقسام الأنسجة3. وتشمل العلامات الرئيسية المستخدمة في تصور التفاعلات الأجسام المضادة المستضد الأصباغ الفلورسنت (الفلور وناعي) وتفاعلات لون الركيزة الانزيم (المناعية، وكلاهما مترافق مع الأجسام المضادة4. باستخدام المراقبة المجهرية من الممكن تحديد توطين الأنسجة المسماة، والذي يتوافق تقريبا مع توطين مستضد الهدف في الأنسجة.
توجد طريقتان لتفاعلات الفلورسنت أو الكرومية للكشف عن البروتين: طريقة الكشف المباشر، التي يتم فيها تسمية الأجسام المضادة الأولية المحددة مباشرة؛ وطريقة الكشف غير المباشر، التي يتم فيها unconjugated الأجسام المضادة الأولية في حين أن الأجسام المضادة الثانوية يحمل التسمية5،6،7. الأسلوب غير المباشر له بعض المزايا، والتي هي أساسا تضخيم الإشارة. وعلاوة على ذلك، وخلافا لغيرها من التقنيات الجزيئية والخلوية، مع الفلور المناعي، فمن الممكن لتصور التوزيع، والترجمة، وتعبير مشترك من اثنين أو أكثر من البروتينات معبرة بشكل تفاضلي داخل الخلايا والأنسجة7. يعتمد اختيار طريقة الكشف المستخدمة على التفاصيل التجريبية.
حتى الآن، IHC يستخدم على نطاق واسع في البحوث الأساسية كأداة قوية وأساسية لفهم توزيع وتوطين المؤشرات الحيوية والتنميط العام للبروتينات المختلفة في الأنسجة البيولوجية من الإنسان إلى اللافقاريات8، 9 , 10 , 11. تساعد هذه التقنية على عرض خريطة للتعبير البروتيني في عدد كبير من الأعضاء الحيوانية الطبيعية والمتغيرة وأنواع الأنسجة المختلفة، مما يدل على احتمال انخفاض أو ارتفاع تنظيم التعبير الناجم عن التغيرات الفسيولوجية والمرضية. IHC هو تقنية حساسة للغاية تتطلب الدقة والاختيار الصحيح للأساليب للحصول على النتائج المثلى12. أولا وقبل كل شيء، يمكن أن تؤدي العديد من العوامل المختلفة مثل التثبيت، والتفاعل المتبادل، واسترجاع مستضد، وحساسية الأجسام المضادة إلى إشارات سلبية إيجابية كاذبة وكاذبة13. اختيار الأجسام المضادة هي واحدة من أهم الخطوات في IHC ويعتمد على خصوصية مستضد وتقاربه مع البروتين والأنواع قيد التحقيق7.
في الآونة الأخيرة، قمنا بتحسين تقنية IHC للكشف عن أعضاء أنظمة أوريكسين /هيبوكرين وإندوكانابينويد في أنسجة حمار وحشي للبالغين. لقد ركزنا بشكل رئيسي على التثبيت، وتضمين الأنسجة باستخدام نهجين مختلفين، وتقسيم وتركيب (التي يمكن أن تؤثر على الدقة والتفاصيل أثناء التحليل المجهري)، وحجب (لمنع إيجابيات كاذبة والحد من الخلفية)14. الخصائص الهامة الأخرى هي خصوصية الأجسام المضادة والانتقائية وإمكانية استنساخ بروتوكولات IHC الفردية. مفتاح توفير خصوصية الأجسام المضادة هو استخدام الضوابط السلبية (بما في ذلك لا الأجسام المضادة الأولية أو الأنسجة التي يعرف أنها لا تعبر عن البروتينات المستهدفة) وكذلك الضوابط الإيجابية (بما في ذلك الأنسجة التي من المعروف أن تعبر عن البروتينات المستهدفة)15 . يتم اختيار الأجسام المضادة لIHC على أساس نوع محدد (احتمال أنها تتفاعل مع مستضد الفائدة) والأجسام المضادة المضادة للكشف عن أنظمة الكشف التي تستخدم4،5،6 7. في حالة مناعي، يتم تحديد لون رد الفعل عن طريق اختيار الكروموسومات المعجل، وعادة ثنائي أمينوبنزيدين (البني)16. من ناحية أخرى، يستخدم immunofluorescence الأجسام المضادة المترافقة مع فلوروفور لتصور التعبير البروتين في أقسام الأنسجة المجمدة ويسمح لتحليل سهلة من البروتينات متعددة فيما يتعلق نظام الكشف الكروموجينيك 5 , 7.
في تقنية مناعية، يتم اقتران الأجسام المضادة الثانوية بالبيوتين، وهو جزيء من الوصلات قادر على تجنيد جزيء مراسل كرومي المنشأ [مجمع فيفين-بيوتين (ABC)]، مما يؤدي إلى تضخيم إشارة تلطيخ. مع طريقة مراسل ABC، يتفاعل الإنزيم البيروكسيديز مع 3،3′-ثنائيأمينو بنزيدين (DAB)، مما ينتج تلطيخ اللون البني بشكل مكثف حيث يرتبط الإنزيم بالأجسام المضادة الثانوية، والتي يمكن تحليلها بعد ذلك بمجهر ضوء عادي. ABC تلطيخ، بسبب تقارب عالية من avidin للالبيوتين، وتنتج رد فعل سريع والأمثل، مع عدد قليل من الأجسام المضادة الثانوية تعلق على موقع التفاعل الأجسام المضادة الأولية. تسمح طريقة الكشف الزحيجية هذه بتحليل كثافة الإشارة، حيث توفر بيانات شبه كمية تستند إلى ارتباط مستويات الإشارة البني بمستويات التعبير البروتيني18.
مع تقنيات الفلور المناعي، يمكن الكشف المتزامن عن البروتينات المتعددة نظرًا لقدرة الفلوروكروم المختلفة على انبعاث الضوء على أطوال موجية فريدة من نوعها، ولكن من المهم اختيار الفلوروكروم بعناية لتقليل التداخل الطيفي 5– وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الأجسام المضادة الأولية في مختلف الأنواع المضيفة يقلل من الصعوبات المتعلقة بالتفاعل المتبادل. في هذه الحالة، كل الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالأنواع تعترف بنوع واحد فقط من الأجسام المضادة الأولية. المراسلون الفلورسنت هي جزيئات عضوية صغيرة، بما في ذلك المشتقات التجارية، مثل أصباغ أليكسا فلور.
وتستخدم العديد من النماذج الحيوانية لفهم الظروف الفسيولوجية والمرضية معينة. حتى الآن، ثبت أن يتم حفظ العديد من المسارات الأيضية على مدى التطور. ولذلك ، يمكن لدراسات IHC في الكائنات الحية النموذجية مثل حمار وحشي توفير نظرة ثاقبة في نشأة وصيانة الظروف المرضية وغير المرضية17. ومن أهداف هذا التقرير توضيح بروتوكولات IHC التي يمكن تنفيذها على أنسجة أسماك حمار وحشي للبالغين وتستخدم للحصول على صور مفصلة لتوزيع وتوطين OXA وOX-2R وCB1R على المستويين المحيطي والمركزي. كما أُبلغ عن بروتوكولات لتطبيق طريقتين رئيسيتين غير مباشرتين من أساليب IHC في الأنسجة المحيطية والمركزية لسمك حمار وحشي بالغ. ويوصف هو الأسلوب غير المباشر، الذي يسمح لتضخيم إشارة في الحالات التي يتم فيها اقتران الأجسام المضادة الثانوية إلى صبغة الفلورسنت (طريقة الفلور المناعي) أو مراسل الإنزيم (طريقة immunoperoxidase). وتملك كل من أساليب الكشف عن الكروموجينيك والفلورسنت مزايا وعيوب. وذكرت في هذا البروتوكول هو استخدام IHC، أساسا الفلور المناعي، في حمار وحشي الكبار، وهو نموذج الحيوان المستخدمة على نطاق واسع لدراسة النظم التي يتم حفظها التطورية عبر الظروف الفسيولوجية والمرضية المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
إعداد عينة
يعد إعداد العينات الخطوة الحاسمة الأولى في IHC. بروتوكول موثوق به يسمح للحفاظ على مورفولوجيا الخلايا، وبنية الأنسجة، ومكافحة الجينات. تتطلب هذه الخطوة جمع الأنسجة الصحيحة، والتثبيت، وتقسيم22،23. الغرض من التثبيت هو الح?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذه الدراسة من قبل Fondi Ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016، جامعة سانيو.
Materials
| Anti CB1 | Abcam | ab23703 | |
| Anti OX-2R | Santa Cruz | sc-8074 | |
| Anti-OXA | Santa Cruz | sc8070 | |
| Aquatex | Merck | 1,085,620,050 | |
| Biotinylated rabbit anti-goat | Vector Lab | BA-5000 | |
| citric acid | Sigma Aldrich | 251275 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon Eclipse Ti2 | |
| Cryostat | Leica Biosystem | CM3050S | |
| DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
| Digital Camera | Leica Biosystem | DFC320 | |
| Digital Camera for confocal microscope | Nikon | DS-Qi2 | |
| Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies | Thermo Fisher | A11055 | |
| Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies | Thermo Fisher | A11058 | |
| Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies | Thermo Fisher | A21206 | |
| Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies | Thermo Fisher | A21207 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20,821,330 | |
| Frozen section compound | Leica Biosystem | FSC 22 Frozen Section Media | |
| H2O2 | Sigma Aldrich | 31642 | |
| HCl | VWR | 20,252,290 | |
| ImmPACT DAB | Vector lab | SK4105 | |
| Microscope | Leica Biosystem | DMI6000 | |
| Microtome | Leica Biosystem | RM2125RT | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4H2O | Sigma Aldrich | S9638 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Normal Rabbit Serum | Vector lab | S-5000 | |
| paraffin wax | Carlo Erba | 46793801 | |
| Paraphormaldeyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| sodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | W302600 | |
| Triton X-100 | Fluka Analytical | 93420 | |
| Trizma | Sigma Aldrich | T1503 | |
| VectaStain Elite ABC Kit | Vector lab | PK6100 | |
| Xylene Pure | Carlo Erba | 392603 |
References
- Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216, 49-67 (1998).
- Haines, D. M., West, K. H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology and pathology. Veterinary Immunology and Immunopathology. , 151-156 (2005).
- Onul, A., et al. Application of immunohistochemical staining to detect antigen destruction as a measure of tissue damage. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (9), 683-693 (2012).
- Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells, II: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
- Coons, A. H., Leduc, E. H., Connolly, J. M. Studies on antibody production, I: a method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. The Journal of Experimental Medicine. 102 (1), 49-60 (1955).
- Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry–the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
- Al-Hussinee, L., et al. Immunohistochemistry and pathology of multiple Great Lakes fish from mortality events associated with viral hemorrhagic septicemia virus type IVb. Diseases of Aquatic Organisms. 93 (2), 117-127 (2011).
- Imperatore, R., et al. Overlapping Distribution of Orexin and Endocannabinoid Receptors and Their Functional Interaction in the Brain of Adult Zebrafish. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 62 (2018).
- Concas, A., et al. Immunochemical Localization of GABAA Receptor Subunits in the Freshwater Polyp Hydra vulgaris. Neurochemical Research. 41 (11), 2914-2922 (2016).
- Mania, M., et al. Expression and distribution of leptin and its receptors in the digestive tract of DIO (diet-induced obese) zebrafish. Annals of Anatomy. , 37-47 (2017).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
- Holmseth, S., et al. Specificity controls for immunocytochemistry: the antigen preadsorption test can lead to inaccurate assessment of antibody specificity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (3), 174-187 (2012).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
- Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
- Cristino, L., et al. Obesity-driven synaptic remodeling affects endocannabinoid control of orexinergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), E2229-E2238 (2013).
- Imperatore, R., et al. Genetic deletion of monoacylglycerol lipase leads to impaired cannabinoid receptor CBR signaling and anxiety-like behavior. Journal of Neurochemistry. 135 (4), 799-813 (2015).
- Laperchia, C., et al. The excitatory/inhibitory input to orexin/hypocretin neuron soma undergoes day/night reorganization. Brain Structure and Function. 222 (8), 3847-3859 (2017).
- Eltoum, I., Fredenburgh, J., Grizzle, W. E. Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. Journal of Histotechnology. 24 (3), 201-210 (2001).
- Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. Public Library of Science One. 6 (8), e23780 (2011).
- Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70 (1), 12-19 (2014).
- Dupre, M. P., Courtade-Saidi, M. Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology. Annales de Pathologie. 32 (6), 433-437 (2012).
- Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of Immunohistochemistry for Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Technique: From Experiments to Hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, 741-748 (2006).
- Giorno, R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagnostic Immunology. 2 (3), 161-166 (1984).
- Ramos-Vara, J. A., Saeteele, J., Howard, G. C., Kaser, M. R. Immunohistochemistry. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 273-314 (2007).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
- Buchwalow, I., Somoloiva, V., Boecker, W., Tiemann, M. Nonspecific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Scientific Reports. 1, 28 (2011).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kalyuzhny, A. E. The dark side of the immunohistochemical moon: industry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (12), 1099-1101 (2009).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: the Histochemical Society’s standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Endocrinology. 155 (3), 676-687 (2014).
- Ivell, R., Teerds, K., Hoffman, G. E. Proper application of antibodies for immunohistochemical detection: antibody crimes and how to prevent them. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
- Boi, G., Scalia, C. R., Gendusa, R., Ronchi, S., Cattoretti, G. Disaccharides Protect Antigens from Drying-Induced Damage in Routinely Processed Tissue Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (1), 18-31 (2016).
- Curran, R. C., Gregory, J. Demonstration of immunoglobulin in cryostat and paraffin sections of human tonsil by immunofluorescence and immunoperoxidase techniques. Effects of processing on immunohistochemical performance of tissues and on the use of proteolytic enzymes to unmask antigens in sections. Journal of Clinical Pathology. 31 (10), 974-983 (1978).
- O’Hurley, G., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8 (4), 783-798 (2014).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
- Mayersbach, H. V. Principles and limitations of immunohistochemical methods. Journal of Royal Microscopical Society. 87 (2), 295-308 (1967).
- Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: from experiments to hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (2), 105-109 (2007).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Mölne, J., Breimer, M. E., Svalander, C. T. Immunoperoxidase versus immunofluorescence in the assessment of human renal biopsies. American Journal of Kidney Diseases. 45 (4), 674-683 (2005).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
- Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. , 1926304 (2017).
- Xie, R., et al. Factors influencing the degradation of archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (4), 356-365 (2011).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques–illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17 (12), 14067-14090 (2012).
- Marks, K. M., Nolan, G. P. Chemical labeling strategies for cell biology. Nature Methods. 3 (8), 591-596 (2006).
