JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생화학

Identifikation af orexin og Endocannabinoide receptorer hos voksne zebrafisk ved hjælp af Immunoperoxidase og immunofluorescens metoder

Published: June 25, 2019
doi:
10.3791/59308
, , , ,
1Department of Sciences and Technologies (DST),University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group,Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions,University of Naples Federico II

Summary

Præsenteret her er protokoller for immunhistokemiske karakterisering og lokalisering af orexin peptid, orexin receptorer, og endocannabinoide receptorer i tarmen og hjernen af normale og kost-induceret fedme (Dio) voksne: zebrafisk modeller ved hjælp af immunoperixidase og dobbelte immunofluorescens metoder.

Abstract

Immun histokemi (IHC) er en meget følsom og specifik teknik, der er involveret i påvisning af Target antigener i vævs sektioner med mærkede antistoffer. Det er en MultiStep proces, hvor optimering af hvert trin er afgørende for at opnå det optimale specifikke signal. Gennem IHC kan der påvises distribution og lokalisering af specifikke biomarkører, som afslører oplysninger om evolutionær bevaring. Desuden giver IHC mulighed for at forstå udtryks-og distributions ændringer af biomarkører under patologiske forhold, såsom fedme. IHC, hovedsagelig immunofluorescens teknik, kan anvendes i voksne zebrafisk til at detektere organiseringen og distributionen af phylogenerede molekyler, men en standard IHC-protokol er ikke estasblished. Orexin og endocannabinoide er to meget velbevaret systemer, der er involveret i kontrol af fødeindtagelse og fedme patologi. Rapporteret her er protokoller, der anvendes til at få oplysninger om orexin peptid (oxa), orexin receptor (Ox-2R), og cannabinoid receptor (CB1R) lokalisering og distribution i tarmen og hjernen af normale og kost-induceret fede (Dio) voksne: zebrafisk modeller. Også beskrevet er metoder til immunoperoxydaseteknik og dobbelt immunofluorescens, samt forberedelse af reagenser, fiksering, paraffin-indlejring, og kryoprotektion af zebrafiske væv og forberedelse til en endogen aktivitet-Blokering trin og baggrund modfarvning. Det komplette sæt af parametre er opnået fra tidligere IHC eksperimenter, hvorigennem vi har vist, hvordan immunofluorescens kan hjælpe med forståelsen af oxs, Ox-2R, og CB1R distribution, lokalisering, og bevaring af udtrykket i voksne: zebrafisk Væv. De resulterende billeder med meget specifik signalintensitet førte til bekræftelsen af, at zebrafisk er egnede dyremodeller til immunohistokemiske studier af distribution, lokalisering og evolutionær bevaring af specifikke biomarkører i fysiologiske og patologiske tilstande. De protokoller, der præsenteres her, anbefales til IHC-eksperimenter i voksne zebrafisk.

Introduction

Immunohistochemistry (IHC) er en veletableret klassisk teknik, der anvendes til at identificere cellulære eller vævs komponenter (antigener) ved antigen-antistof interaktion1,2. Det kan bruges til at identificere lokalisering og distribution af målbiomolekyler i et væv. IHC anvender immunologiske og kemiske reaktioner til påvisning af antigener i vævs afsnit3. De vigtigste markører, der anvendes til visualisering af antigen-antistof interaktioner omfatter fluorescerende farvestoffer (immunofluorescens) og enzym-substrat farve reaktioner (immunoperoxidase), både konjugeret til antistoffer4. Brug af mikroskopisk observation er muligt at bestemme lokalisering af mærkede væv, som omtrent svarer til lokalisering af målantigen i vævet.

Der findes to metoder til fluorescerende eller kromogeniske reaktioner til påvisning af protein: den direkte påvisningsmetode, hvor det specifikke primære antistof er direkte mærket; og den indirekte detektionsmetode, hvor det primære antistof er ukonjugeret, mens det sekundære antistof bærer etiketten5,6,7. Den indirekte metode har nogle fordele, som primært er dens signal forstærkning. Desuden, i modsætning til andre molekylære og cellulære teknikker, med immunofluorescens, er det muligt at visualisere fordelingen, lokalisering, og coexpression af to eller flere proteiner differentielt udtrykt i celler og væv7. Valget af den detekterings metode, der anvendes, afhænger af eksperimentelle detaljer.

Til dato, IHC er meget udbredt i grundforskning som et kraftfuldt og vigtigt redskab til at forstå fordelingen og lokalisering af biomarkører og den generelle profilering af forskellige proteiner i biologisk væv fra humane til hvirvelløse dyr8, 9 ud af , 10 stk. , 11. teknikken hjælper med at vise et kort over protein ekspression i et stort antal normale og ændrede dyreorganer og forskellige vævstyper, der viser mulig ned-eller op-regulering af udtryk induceret af fysiologiske og patologiske ændringer. IHC er en meget følsom teknik, der kræver nøjagtighed og det korrekte valg af metoder for at opnå optimale resultater12. Først og fremmest kan mange forskellige faktorer, såsom fiksering, Cross-reaktivitet, antigen hentning, og følsomhed af antistoffer føre til falsk positive og falsk negative signaler13. Udvælgelsen af antistoffer er et af de vigtigste trin i IHC og afhænger af antigen specificiteten og dens affinitet til det protein og de arter, der er omfattet af undersøgelsen7.

For nylig har vi optimeret IHC teknik til at detektere medlemmer af orexin/hypocretin og endocannabinoide systemer i voksne: zebrafisk væv. Vi har primært fokuseret på fiksering, vævs integrering ved hjælp af to forskellige tilgange, skæring og montage (hvilket kan påvirke opløsningen og detaljerne under mikroskopisk analyse) og blokering (for at forhindre falsk positiver og reducere baggrunden)14. Andre vigtige karakteristika er antistof specificitet og selektivitet og reproducerbarhed af individuelle IHC-protokoller. Nøglen til at give antistof specificitet er brugen af negative kontroller (herunder ingen primære antistoffer eller væv, der vides ikke at udtrykke målproteinerne) samt positive kontroller (herunder væv, der er kendt for at udtrykke målproteinerne)15 . Udvælgelsen af antistoffer mod IHC sker på grundlag af deres Arts specificitet (sandsynligheden for, at de reagerer med det antigen, der er af interesse), og de antigen-antistof-bindings detektionssystemer, der anvendes4,5,6 ,7. I tilfælde af immunoperoxidase bestemmes reaktions farven ved valg af det udfællende kromogen, sædvanligvis diaminobenzidin (brun)16. På den anden side, jegmmunofluorescence udnytter antistoffer konjugeret med en fluorophor at visualisere protein udtryk i frosne væv sektioner og giver mulighed for nem analyse af flere proteiner i forhold til det kromogene detekteringssystem 5 ) i , 7. der er

I immunoperoxidaseteknikken er det sekundære antistof konjugeret til biotin, et linker-molekyle, der kan rekruttere et kromogen reporter molekyle [Avidin-biotin Complex (ABC)], hvilket fører til forstærkning af farvnings signalet. Med ABC reporter-metoden reagerer enzymet peroxidase med 3, 3 ‘-diaminobenzidin (DAB), hvilket producerer en intenst brunfarvet farvning, hvor enzymet binder sig til det sekundære antistof, som derefter kan analyseres med et almindeligt lysmikroskop. ABC farvning, på grund af den høje affinitet af begærlighed for biotin, producerer en hurtig og optimal reaktion, med få sekundære antistoffer knyttet til stedet for den primære antistof reaktivitet. Denne kromogene detektionsmetode giver mulighed for en densitometrisk analyse af signalet, der giver semi-kvantitative data baseret på korrelationen af brune signal niveauer med protein Expression niveauer18.

Med immunofluorescens teknikker er samtidig påvisning af flere proteiner mulig på grund af forskellige fluorchrominers evne til at udsende lys ved unikke bølgelængder, men det er vigtigt at vælge fluorokromer omhyggeligt for at minimere spektral overlap 5. Desuden minimerer brugen af primære antistoffer i forskellige værtsarter vanskeligheder med hensyn til kryds reaktivitet. I dette tilfælde genkender hvert artsspecifikt sekundært antistof kun én type primær antistof. Fluorescerende reportere er små organiske molekyler, herunder kommercielle derivater, såsom Alexa fluor farvestoffer.

Mange dyremodeller bruges til at forstå særlige fysiologiske og patologiske tilstande. Til dato er det fastslået, at mange metaboliske veje er bevaret i løbet af udviklingen. Derfor kan IHC-studier i modelorganismer såsom zebrafisk give indsigt i tilblivelsen og vedligeholdelsen af patologiske og ikke-patologiske tilstande17. Det er et formål med denne rapport at illustrere IHC protokoller, der kan udføres på voksne zebrafiske væv og anvendes til at opnå detaljerede billeder af distributionen og lokalisering af OXA, OX-2R, og CB1R på perifert og centralt niveau. Også rapporteret er protokoller for anvendelse af to store IHC indirekte metoder i perifert og centralt væv af voksne zebrafish. Beskrevet er den indirekte metode, som giver mulighed for signal forstærkning i tilfælde, hvor et sekundært antistof konjugeres til et fluorescerende farvestof (immunofluorescens metode) eller enzym reporter (immunoperoxidasemetode). Både kromogeniske og fluorescerende detekteringsmetoder besidder fordele og ulemper. Rapporteret i denne protokol er brugen af IHC, hovedsagelig immunofluorescens, i voksne zebrafisk, en dyremodel udbredte til at studere systemer, der er evolutionære bevaret på tværs af forskellige fysiologiske og patologiske betingelser.

Protocol

1. immunoperoxidase-protokol Bemærk: zebrafiskene blev fremstillet af Prof. Omid Safari (Department of Fisheries, Faculty of naturressourcer og miljø, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran)10. Vævs dissektion Ofrer zebrafiskene ved nedsænkning i isvand (5 dele is/1 del vand, 4 °C); forlade dem, indtil ophør af alle bevægelser for at sikre døden ved hypoxi. Fjern hurtigt tarmen og hjernen med følgende disse…

Representative Results

Repræsentative data for immunoperoxidasefarvningen er vist i figur 1 og figur 2. Immunohistokemisk analyse af Ox-a-og OX-2R-distributionen i tarmen hos voksne zebrafisk viste forskellige lokaliseringssteder for Ox-a og OX-2R og deres stigning i ekspression i tarmcellerne i Dio: zebrafisk. En intens brunfarvning for OX-A blev observeret i cellerne i den mediale og forreste tarm (figur 1a, A1). Den immunoexpression af OX-A…

Discussion

Forberedelse af prøver

Prøveforberedelse er det første kritiske trin i IHC. En pålidelig protokol giver mulighed for vedligeholdelse af cellernes morfologi, vævs arkitektur og antigenicitet. Dette trin kræver korrekt vævs indsamling, fikse ring og skæring22,23. Formålet med fiksering er at bevare væv og reducere virkningen af vævs enzymer eller mikroorganismer. Fikserings trinnet bevarer især cellul?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne undersøgelse blev støttet af Fondi Ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016, University of Sannio.

Materials

Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216, 49-67 (1998).
  2. Haines, D. M., West, K. H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology and pathology. Veterinary Immunology and Immunopathology. , 151-156 (2005).
  3. Onul, A., et al. Application of immunohistochemical staining to detect antigen destruction as a measure of tissue damage. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (9), 683-693 (2012).
  4. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  5. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells, II: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  6. Coons, A. H., Leduc, E. H., Connolly, J. M. Studies on antibody production, I: a method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. The Journal of Experimental Medicine. 102 (1), 49-60 (1955).
  7. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry–the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
  8. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  9. Al-Hussinee, L., et al. Immunohistochemistry and pathology of multiple Great Lakes fish from mortality events associated with viral hemorrhagic septicemia virus type IVb. Diseases of Aquatic Organisms. 93 (2), 117-127 (2011).
  10. Imperatore, R., et al. Overlapping Distribution of Orexin and Endocannabinoid Receptors and Their Functional Interaction in the Brain of Adult Zebrafish. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 62 (2018).
  11. Concas, A., et al. Immunochemical Localization of GABAA Receptor Subunits in the Freshwater Polyp Hydra vulgaris. Neurochemical Research. 41 (11), 2914-2922 (2016).
  12. Mania, M., et al. Expression and distribution of leptin and its receptors in the digestive tract of DIO (diet-induced obese) zebrafish. Annals of Anatomy. , 37-47 (2017).
  13. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  14. Holmseth, S., et al. Specificity controls for immunocytochemistry: the antigen preadsorption test can lead to inaccurate assessment of antibody specificity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (3), 174-187 (2012).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  18. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  19. Cristino, L., et al. Obesity-driven synaptic remodeling affects endocannabinoid control of orexinergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), E2229-E2238 (2013).
  20. Imperatore, R., et al. Genetic deletion of monoacylglycerol lipase leads to impaired cannabinoid receptor CBR signaling and anxiety-like behavior. Journal of Neurochemistry. 135 (4), 799-813 (2015).
  21. Laperchia, C., et al. The excitatory/inhibitory input to orexin/hypocretin neuron soma undergoes day/night reorganization. Brain Structure and Function. 222 (8), 3847-3859 (2017).
  22. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Grizzle, W. E. Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. Journal of Histotechnology. 24 (3), 201-210 (2001).
  23. Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. Public Library of Science One. 6 (8), e23780 (2011).
  24. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70 (1), 12-19 (2014).
  25. Dupre, M. P., Courtade-Saidi, M. Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology. Annales de Pathologie. 32 (6), 433-437 (2012).
  26. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of Immunohistochemistry for Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Technique: From Experiments to Hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, 741-748 (2006).
  27. Giorno, R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagnostic Immunology. 2 (3), 161-166 (1984).
  28. Ramos-Vara, J. A., Saeteele, J., Howard, G. C., Kaser, M. R. Immunohistochemistry. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 273-314 (2007).
  29. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  30. Buchwalow, I., Somoloiva, V., Boecker, W., Tiemann, M. Nonspecific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Scientific Reports. 1, 28 (2011).
  31. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  32. Kalyuzhny, A. E. The dark side of the immunohistochemical moon: industry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (12), 1099-1101 (2009).
  33. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: the Histochemical Society’s standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Endocrinology. 155 (3), 676-687 (2014).
  34. Ivell, R., Teerds, K., Hoffman, G. E. Proper application of antibodies for immunohistochemical detection: antibody crimes and how to prevent them. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  35. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  36. Boi, G., Scalia, C. R., Gendusa, R., Ronchi, S., Cattoretti, G. Disaccharides Protect Antigens from Drying-Induced Damage in Routinely Processed Tissue Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (1), 18-31 (2016).
  37. Curran, R. C., Gregory, J. Demonstration of immunoglobulin in cryostat and paraffin sections of human tonsil by immunofluorescence and immunoperoxidase techniques. Effects of processing on immunohistochemical performance of tissues and on the use of proteolytic enzymes to unmask antigens in sections. Journal of Clinical Pathology. 31 (10), 974-983 (1978).
  38. O’Hurley, G., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8 (4), 783-798 (2014).
  39. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  40. Mayersbach, H. V. Principles and limitations of immunohistochemical methods. Journal of Royal Microscopical Society. 87 (2), 295-308 (1967).
  41. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: from experiments to hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (2), 105-109 (2007).
  42. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  43. Mölne, J., Breimer, M. E., Svalander, C. T. Immunoperoxidase versus immunofluorescence in the assessment of human renal biopsies. American Journal of Kidney Diseases. 45 (4), 674-683 (2005).
  44. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  45. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. , 1926304 (2017).
  46. Xie, R., et al. Factors influencing the degradation of archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (4), 356-365 (2011).
  47. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  48. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques–illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17 (12), 14067-14090 (2012).
  49. Marks, K. M., Nolan, G. P. Chemical labeling strategies for cell biology. Nature Methods. 3 (8), 591-596 (2006).

Tags

Keywords: ImmunohistochemistryImmunoperoxidaseImmunofluorescenceZebrafishOrexinEndocannabinoid ReceptorsCryosectioningBlockingPrimary AntibodiesIncubation
check_url/kr/59308?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Imperatore, R., D’Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image