Identification des récepteurs d'orexine et d'endocannabinoïdes chez le poisson zèbre adulte à l'aide de méthodes d'immunoperoxidase et d'immunofluorescence

Summary

Présentés ici sont des protocoles pour la caractérisation immunohistochimique et la localisation du peptide d’orexine, des récepteurs d’orexin, et des récepteurs endocannabinoïdes dans l’intestin et les cerveaux des modèles normaux et induits par l’obésité de régime (DIO) de poissons zèbres adultes utilisant immunoperixidase et les méthodes d’immunofluorescence double.

Abstract

L’immunohistochimie (IHC) est une technique très sensible et spécifique impliquée dans la détection d’antigènes cibles dans les sections tissulaires avec des anticorps étiquetés. Il s’agit d’un processus en plusieurs étapes dans lequel l’optimisation de chaque étape est cruciale pour obtenir le signal spécifique optimal. Grâce au CSI, la distribution et la localisation de biomarqueurs spécifiques peuvent être détectées, révélant des informations sur la conservation évolutive. En outre, le CSI permet de comprendre les changements d’expression et de distribution des biomarqueurs dans des conditions pathologiques, comme l’obésité. IHC, principalement la technique d’immunofluorescence, peut être utilisé chez les poissons zèbres adultes pour détecter l’organisation et la distribution des molécules phylogénétiquement conservées, mais un protocole Standard IHC n’est pas estasblished. L’orexine et l’endocannabinoïde sont deux systèmes hautement conservés impliqués dans le contrôle de l’apport alimentaire et de la pathologie de l’obésité. Les protocoles utilisés ici sont utilisés pour obtenir des informations sur le peptide orexin (OXA), le récepteur de l’orexine (OX-2R) et la localisation et la distribution des récepteurs cannabinoïdes (CB1R) dans l’intestin et le cerveau des modèles de poissons zèbres adultes obèses normaux et induits par l’alimentation (DIO). Sont également décrits des méthodes pour l’immunoperoxidase et la double immunofluorescence, aussi bien que la préparation des réactifs, de fixation, de paraffin-embedding, et de cryoprotection du tissu de poisson zèbre et la préparation pour une étape et arrière-plan endogènes de blocage d’activité contre-staining. L’ensemble complet des paramètres est obtenu à partir d’expériences précédentes du CSI, grâce auxquelles nous avons montré comment l’immunofluorescence peut aider à comprendre les OX, l’OX-2R et la distribution, la localisation et la conservation de l’expression chez les poissons zèbres adultes. Tissus. Les images résultantes avec une intensité de signal très spécifique ont conduit à la confirmation que le poisson zèbre sont des modèles animaux appropriés pour les études immunohistochimiques de la distribution, de la localisation et de la conservation évolutive de biomarqueurs spécifiques dans conditions physiologiques et pathologiques. Les protocoles présentés ici sont recommandés pour les expériences du CSI chez les poissons zèbres adultes.

Introduction

L’immunohistochimie (IHC) est une technique classique bien établie utilisée pour identifier les composants cellulaires ou tissulaires (antigènes) par interaction antigène-anticorps^1,2. Il peut être utilisé pour identifier la localisation et la distribution des biomolécules cibles dans un tissu. Le CSI utilise des réactions immunologiques et chimiques pour détecter les antigènes dans les sections tissulaires³. Les principaux marqueurs utilisés pour la visualisation des interactions antigène-anticorps comprennent les colorants fluorescents (immunofluorescence) et les réactions de couleur enzyme-substrat (immunoperoxidase), tous deux conjugués aux anticorps⁴. L’utilisation de l’observation microscopique est possible pour déterminer la localisation des tissus étiquetés, ce qui correspond approximativement à la localisation de l’antigène cible dans le tissu.

Deux méthodes existent pour les réactions fluorescentes ou chromogéniques pour détecter les protéines : la méthode de détection directe, dans laquelle l’anticorps primaire spécifique est directement étiqueté; et la méthode de détection indirecte, dans laquelle l’anticorps primaire est non conjugué tandis que l’anticorps secondaire porte l’étiquette^5,6,7. La méthode indirecte présente certains avantages, qui sont principalement son amplification du signal. En outre, contrairement à d’autres techniques moléculaires et cellulaires, avec l’immunofluorescence, il est possible de visualiser la distribution, la localisation et la coexpression de deux protéines ou plus exprimées différemment dans les cellules et les tissus⁷. Le choix de la méthode de détection utilisée dépend des détails expérimentaux.

À ce jour, iHC est largement utilisé dans la recherche fondamentale comme un outil puissant et essentiel pour comprendre la distribution et la localisation des biomarqueurs et le profilage général des différentes protéines dans les tissus biologiques de l’homme aux invertébrés^{8, 9} (en) ^{, 10} Ans et plus ^{, 11}. La technique aide à afficher une carte de l’expression des protéines dans un grand nombre d’organes animaux normaux et altérés et de différents types de tissus, montrant la possibilité de descendre ou de modifier l’expression induite par des changements physiologiques et pathologiques. IHC est une technique très sensible qui nécessite une précision et le bon choix de méthodes pour obtenir des résultats optimaux¹². Tout d’abord, de nombreux facteurs différents tels que la fixation, la réactivité croisée, la récupération d’antigènes et la sensibilité des anticorps peuvent conduire à de faux signaux positifs et faux négatifs¹³. La sélection des anticorps est l’une des étapes les plus importantes du CSI et dépend de la spécificité de l’antigène et de son affinité avec les protéines et les espèces à l’étude⁷.

Récemment, nous avons optimisé la technique du CSI pour détecter les membres de l’orexine/hypocrétine et des systèmes endocannabinoïdes dans le tissu adulte de poisson zèbre. Nous nous sommes concentrés principalement sur la fixation, l’intégration tissulaire à l’aide de deux approches différentes, la section et le montage (qui peuvent affecter la résolution et le détail lors de l’analyse microscopique), et le blocage (pour prévenir les faux positifs et réduire le fond)¹⁴. D’autres caractéristiques importantes sont la spécificité et la sélectivité des anticorps et la reproductibilité des protocoles individuels du Ci-Ph. La clé pour fournir la spécificité d’anticorps est l’utilisation des contrôles négatifs (y compris aucun anticorps primaire ou tissu qui est connu pour ne pas exprimer les protéines cibles) aussi bien que des contrôles positifs (y compris le tissu qui est connu pour exprimer les protéines cibles)¹⁵ . La sélection des anticorps pour iHC est faite en fonction de leur spécificité de l’espèce (la probabilité avec laquelle ils réagissent avec l’antigène d’intérêt) et des systèmes de détection de liaison antigène-anticorps qui sont utilisés^{4,5,6 ,7}. Dans le cas de l’immunoperoxidase, la couleur de la réaction est déterminée par la sélection du chromogène précipitant, habituellement diaminobenzidine (brun)¹⁶. D’autre part, immunofluorescence utilise des anticorps conjugués avec un fluorophor pour visualiser l’expression des protéines dans les sections de tissus congelés et permet une analyse facile de protéines multiples en ce qui concerne le système de détection chromogénique ^{5 Annonces , 7}.

Dans la technique d’immunoperoxidase, l’anticorps secondaire est conjugué à la biotine, une molécule de liaison capable de recruter une molécule journaliste chromogénique [complexe d’avidin-biotine (ABC)], conduisant à l’amplification du signal de coloration. Avec la méthode de journaliste d’ABC, l’enzyme peroxidase réagit avec 3,3′-diaminobenzidine (DAB), produisant une coloration intensément brune où l’enzyme se lie à l’anticorps secondaire, qui peut alors être analysée avec un microscope léger ordinaire. La coloration d’ABC, due à la forte affinité de l’avidine pour la biotine, produit une réaction rapide et optimale, avec peu d’anticorps secondaires attachés au site de la réactivité primaire d’anticorps. Cette méthode de détection chromogénique permet l’analyse densitométrique du signal, fournissant des données semi-quantitatives basées sur la corrélation des niveaux de signal brun avec les niveaux d’expression protéique¹⁸.

Avec les techniques d’immunofluorescence, la détection simultanée de protéines multiples est possible en raison de la capacité de différents fluorochromes à émettre de la lumière à des longueurs d’onde uniques, mais il est important de choisir les fluorochromes avec soin pour minimiser les chevauchements ^{spectrals 5}. En outre, l’utilisation d’anticorps primaires chez différentes espèces hôtes minimise les difficultés liées à la réactivité croisée. Dans ce cas, chaque anticorps secondaire spécifique à une espèce ne reconnaît qu’un seul type d’anticorps primaires. Les reporters fluorescents sont de petites molécules organiques, y compris des dérivés commerciaux, comme les colorants Alexa Fluor.

De nombreux modèles animaux sont utilisés pour comprendre des conditions physiologiques et pathologiques particulières. À ce jour, il est établi que de nombreuses voies métaboliques sont conservées au cours de l’évolution. Par conséquent, les études du CIS dans des organismes modèles tels que le poisson zèbre peuvent fournir un aperçu de la genèse et du maintien des conditions pathologiques et non pathologiques¹⁷. C’est un but de ce rapport pour illustrer des protocoles d’IHC qui peuvent être exécutés sur le tissu adulte de poisson zèbre et employés pour obtenir des images détaillées de la distribution et de la localisation d’OXA, d’OX-2R, et de CB1R aux niveaux périphériques et centraux. On signale également des protocoles pour l’application de deux principales méthodes indirectes du CIS dans les tissus périphériques et centraux du poisson zèbre adulte. La méthode indirecte, qui permet l’amplification du signal dans les cas où un anticorps secondaire est conjugué à un colorant fluorescent (méthode d’immunofluorescence) ou à un reporter enzymatique (méthode d’immunoperoxidase). Les méthodes de détection chromogéniques et fluorescentes possèdent des avantages et des inconvénients. Rapporté dans ce protocole est l’utilisation de IHC, principalement l’immunofluorescence, chez le poisson zèbre adulte, un modèle animal largement utilisé pour étudier les systèmes qui sont évolutifs conservés à travers différentes conditions physiologiques et pathologiques.

Protocol

1. Protocole d’immunoperoxidase REMARQUE: Le poisson zèbre a été obtenu par le professeur Omid Safari (Département des pêches, Faculté des ressources naturelles et de l’environnement, Université Ferdowsi de Mashhad, Mashhad, Iran)10. Dissection tissulaire Sacrifier le poisson zèbre par submersion dans l’eau glacée (5 parties de glace/1 partie d’eau, 4 oC); les laisser jusqu’à la cessation de tout mouvement pour assurer la m…

Representative Results

Les données représentatives de la coloration immunoperoxidase sont présentées à la figure 1 et à la figure 2. L’analyse immunohistochimique de la distribution d’OX-A et d’OX-2R dans l’intestin du poisson zèbre adulte a montré différents sites de localisation d’OX-A et d’OX-2R et leurs augmentations d’expression dans les cellules intestinales du poisson zèbre dio. Une coloration brune intense pour l’OX-A a été observée dans les cellules de l’intestin…

Discussion

Préparation de l’échantillon

La préparation d’échantillons est la première étape critique du CSI. Un protocole fiable permet le maintien de la morphologie cellulaire, de l’architecture tissulaire et de l’antigénicité. Cette étape nécessite la collecte correcte de tissu, la fixation, et la section^22,23. Le but de la fixation est de préserver les tissus et de réduire l’action des enzymes tissulaires ou…

Materials

Anti CB1	Abcam	ab23703
Anti OX-2R	Santa Cruz	sc-8074
Anti-OXA	Santa Cruz	sc8070
Aquatex	Merck	1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat	Vector Lab	BA-5000
citric acid	Sigma Aldrich	251275
Confocal microscope	Nikon	Nikon Eclipse Ti2
Cryostat	Leica Biosystem	CM3050S
DAPI	Sigma Aldrich	32670
Digital Camera	Leica Biosystem	DFC320
Digital Camera for confocal microscope	Nikon	DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A21207
Ethanol absolute	VWR	20,821,330
Frozen section compound	Leica Biosystem	FSC 22 Frozen Section Media
H2O2	Sigma Aldrich	31642
HCl	VWR	20,252,290
ImmPACT DAB	Vector lab	SK4105
Microscope	Leica Biosystem	DMI6000
Microtome	Leica Biosystem	RM2125RT
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
NaH2PO4H2O	Sigma Aldrich	S9638
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
Normal Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663
Normal Rabbit Serum	Vector lab	S-5000
paraffin wax	Carlo Erba	46793801
Paraphormaldeyde	Sigma Aldrich	P6148
sodium citrate dihydrate	Sigma Aldrich	W302600
Triton X-100	Fluka Analytical	93420
Trizma	Sigma Aldrich	T1503
VectaStain Elite ABC Kit	Vector lab	PK6100
Xylene Pure	Carlo Erba	392603