JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

זיהוי של הקולטנים Orexin ו אנדוקאנאיאיד ב בוגרים Zebrafish באמצעות פרוקסידאז ואימונוofloroiסנס שיטות

Published: June 25, 2019
doi:
10.3791/59308
, , , ,
1Department of Sciences and Technologies (DST),University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group,Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions,University of Naples Federico II

Summary

הציגו כאן הם פרוטוקולים עבור האפיון אימונוהיסטוכימיה ולוקליזציה של מזון orexin, וקולטנים orexin, ו קולטנים אנדוקאנביאיד בבטן ובמוחות של השמנה רגילה דיאטה המושרה (DIO) בוגרים דג זברה מודלים באמצעות שיטות אימונוimmunoperixidase וכפולות.

Abstract

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה מאוד רגיש וספציפי מעורב בזיהוי של אנטיגנים היעד בסעיפים רקמה עם נוגדנים עם תוויות. זהו תהליך רב-שלבים שבו האופטימיזציה של כל שלב חיונית להשגת האות הספציפי האופטימלי. באמצעות IHC, ניתן לזהות את ההפצה והלוקליזציה של סמנים ספציפיים ולחשוף מידע על שימור אבולוציוני. יתר על כן, IHC מאפשר הבנה של ביטוי והפצה של שינויי הסמנים בתנאים פתולוגיים, כגון השמנה. IHC, בעיקר את הטכניקה החיסונית, ניתן להשתמש בדגים מבוגרים כדי לזהות את הארגון והפצה של מולקולות שימור של phylogenetically, אבל פרוטוקול IHC סטנדרטי אינו מהווה הליך מגנטי. Orexin ו אנדוקאנאיאיד הם שתי מערכות שמרו במיוחד מעורבים בשליטה של צריכת מזון פתולוגיה השמנה. שדווחו כאן הם פרוטוקולים המשמשים להשגת מידע על orexin פפטיד (OXA), קולטן orexin (OX-2R), ו קולטן קנביאיד (CB1R) לוקליזציה והפצה בבטן ובמוח של נורמלי המושרה דיאטה שמנים (DIO) מבוגרים דגים מודלים. כמו כן תיאר הן שיטות לפרוקסידאז וכפולה החיסונית, כמו גם הכנת ריאגנטים, קיבעון, פרפין-הטבעה, והקפאה של רקמת דג זברה והכנה עבור הפעילות האנדוגניים בשלב והרקע כתמים מנגד. מערכת הפרמטרים המלאה מתקבלת מניסויים קודמים של IHC, שדרכם הראינו כיצד מערכת חיסונית יכולה לסייע בהבנת ה-OXs, OX-2R והפצת CB1R, לוקליזציה ושימור ביטוי בדגי מבוגר רקמות. התמונות המתקבלות עם עוצמת אות ספציפית מאוד הובילה לאישור כי דג זברה מתאימים מודלים בעלי חיים עבור מחקרים אימונוהיסטוכימיה של הפצה, לוקליזציה, ושימור אבולוציוני של סמנים ספציפיים ב מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. הפרוטוקולים המוצגים כאן מומלצים לניסויי IHC בדגי מבוגרים.

Introduction

אימונוהיסטוכימיה (ihc) היא טכניקה קלאסית הוקמה היטב בשימוש כדי לזהות רכיבים סלולריים או רקמות (אנטיגנים) על ידי הנוגדן אנטיגן אינטראקציה1,2. ניתן להשתמש בו כדי לזהות את הלוקליזציה וההפצה של biomolecules היעד בתוך הרקמה. IHC משתמשת בתגובות אימונולוגיים וכימיים כדי לזהות אנטיגנים בסעיפים רקמות3. הסמנים העיקריים המשמשים להדמיה של אינטראקציות אנטיגן-נוגדן כוללים צבעי פלורסנט (immunofluorescence) ו-המצע האנזים התגובות צבע (פרוקסידאז), שניהם מצוענים ל נוגדנים4. באמצעות תצפית מיקרוסקופית ניתן לקבוע את הלוקליזציה של רקמת התווית, אשר בקירוב מתאים ללוקליזציה של אנטיגן היעד ברקמה.

שתי שיטות קיימות עבור התגובות פלורסנט או כרומוגניים כדי לזהות חלבון: שיטת איתור ישירה, שבה הנוגדן העיקרי הספציפי מתויג ישירות; ואת השיטה לזיהוי עקיף, שבו הנוגדן העיקרי הוא בלתי מצומת בעוד הנוגדן המשני נושאת את התווית5,6,7. לשיטה העקיפה יש כמה יתרונות, שהוא בעיקר הגברה האותות שלה. כמו-כן, בניגוד לטכניקות מולקולאריות אחרות של מולקולות וסלולר, ניתן לדמיין את ההפצה, הלוקליזציה והביטוי של שני חלבונים או יותר המתבטאים בתוך תאים ורקמות7. בחירת שיטת האיתור המשמשת בשימוש תלויה בפרטים הניסיוניים.

עד כה, IHC משמשת רבות במחקר בסיסי ככלי רב עוצמה וחיוני כדי להבין את ההפצה והלוקליזציה של סמנים ביולוגיים ואת הפרופיל הכללי של חלבונים שונים ברקמות ביולוגיות מאדם לחסרי חוליות8, מיכל בן 10 , מיכל עשור , 11. הטכניקה מסייעת להציג מפה של ביטוי החלבון במספר רב של אברי בעלי חיים רגילים ושונים וסוגי רקמות שונות, המראים אפשרות כלפי מטה או מעלה ביטוי הנגרם על-ידי שינויים פיזיולוגיים ופתולוגיים. IHC היא טכניקה רגישה מאוד הדורשת דיוק ובחירה נכונה של שיטות להשגת תוצאות אופטימליות12. קודם כל, גורמים שונים רבים כגון קיבעון, לחצות את הפעילות, לאחזור אנטיגן, ורגישות של נוגדנים יכול להוביל שווא חיובי שווא אותות שליליים13. בחירת הנוגדנים היא אחד השלבים החשובים ביותר ב-IHC והיא תלויה במגוון האנטיגן ובזיקה לחלבון ולמינים הנמצאים תחת חקירה7.

לאחרונה, יש לנו אופטימיזציה של הטכניקה ihc כדי לזהות חברים של orexin/היפושנון מערכות אנדוקנאיאיד בתוך רקמת מבוגרים דג זברה. אנו מתמקדים בעיקר על קיבוע, רקמה הטבעה באמצעות שתי גישות שונות, הפרדה והרכבה (אשר יכול להשפיע על החלטה ופרטים במהלך ניתוח מיקרוסקופיים), חסימה (כדי למנוע תוצאות חיוביות שווא ולהפחית את הרקע)14. מאפיינים חשובים אחרים הם הנוגדנים מפרט ובסלקטיביות והשכולים של פרוטוקולים IHC בודדים. המפתח למתן ספציפיות נוגדן הוא השימוש של פקדים שליליים (כולל לא נוגדנים הראשי או רקמות כי ידוע לא לבטא את החלבונים היעד), כמו גם פקדים חיוביים (כולל רקמות כי ידוע לבטא את החלבונים היעד)15 . בחירת נוגדנים עבור ihc מבוססת על בסיס המינים שלהם-ספציפיות (הסבירות שבה הם מגיבים עם אנטיגן של עניין) ואת אנטיגן-נוגדן מערכות זיהוי מחייב המשמש4,5,6 ,7. במקרה של פרוקסידאז, הצבע של התגובה נקבע על ידי הבחירה של כרומוגן התלול, בדרך כלל diaminobenzidine (חום)16. מצד שני, אנימשתמש בנוגדנים בעלי מצועם עם פלואורופראור כדי להמחיש ביטוי חלבון במקטעים של רקמות קפואות ומאפשר ניתוח קל של חלבונים מרובים ביחס למערכת האיתור הרומוגנית מיכל 5 , 7. לאחר מכן

בטכניקת פרוקסידאז, הנוגדן המשני הוא מעלה באוב כדי biotin, מולקולה מקשר מסוגל לגייס מולקולה עיתונאי כרומוגניים [avidin-biotin קומפלקס (ABC)], המוביל הגברה של האות מכתים. עם שיטת העיתונאי ABC, האנזים peroxidase מגיב עם 3, 3 ‘-diaminobenzidine (בתוספת), הפקת כתמים בצבע חום אינטנסיבי שבו האנזים נקשר הנוגדן המשני, אשר ניתן לנתח עם מיקרוסקופ אור רגיל. כתמים ABC, בשל הזיקה הגבוהה של אבידין עבור biotin, מייצרת תגובה מהירה ואופטימלית, עם כמה נוגדנים משניים המחוברים לאתר של הנוגדן העיקרי הפעילות. שיטת זיהוי כרומוגניים זו מאפשרת ניתוח הדסיטומטלי של האות, המספקת נתונים חצי כמותיים המבוססים על התאמה של רמות האות החום עם ביטוי חלבון רמות18.

עם שיטות immunofluorescence גילוי סימולטני של חלבונים מרובים אפשרי בשל היכולת של fluorochromes שונים כדי לפלוט אור באורכי גל ייחודיים, אבל חשוב לבחור fluorochromes בזהירות כדי למזער חפיפה ספקטרלית 5. יתר על כן, השימוש בנוגדנים העיקריים במינים מארחים שונים ממזער את הקשיים הנוגעים לפעילות החוצה. במקרה זה, כל מיני-נוגדן משני ספציפי מזהה רק סוג אחד של נוגדן ראשוני. כתבים פלואורסצנט הם מולקולות אורגניות קטנות, כולל נגזרים מסחריים, כגון אלקסה פלואו צבעים.

מודלים רבים של בעלי חיים משמשים להבנת מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים מסוימים. עד כה, הוא הוקם כי מסלולים מטבולית רבים נשמרים במהלך האבולוציה. לכן, מחקרי IHC במודלים של אורגניזמים כגון מצדגים יכולים לספק תובנה לבראשית ולתחזוקה של מצבים פתולוגיים ובלתי פתולוגיים17. זוהי מטרת דו ח זה כדי להמחיש פרוטוקולים ihc כי ניתן לבצע על רקמת דג זברה למבוגרים ולהשתמש כדי לקבל תמונות מפורטות של הפצה ולוקליזציה של oxa, OX-2r, ו CB1R ברמות היקפיים והמרכזי. דווח גם הם פרוטוקולים עבור יישום של שתי שיטות הגדולות IHC עקיף ברקמות היקפיים והמרכזית של דג מבוגר. מתוארים היא שיטה עקיפה, אשר מאפשרת הגברה האות במקרים שבהם נוגדן משני מצומת לצבוע פלורסנט (שיטת החיסונית) או כתב אנזים (פרוקסידאז שיטה). הן כרומוגניים והן שיטות זיהוי פלורסנט בעלי יתרונות וחסרונות. מדווח בפרוטוקול זה הוא השימוש ב-IHC, בעיקר במערכת החיסונית, מדגם בעלי חיים הנפוץ ביותר ללימוד מערכות ההתפתחותיות בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים שונים.

Protocol

1. פרוטוקול פרוקסידאז הערה: הדגים מתקבלים על ידי פרופ ‘ אומיד ספארי (המחלקה לדיג, הפקולטה למשאבי טבע וסביבה, אוניברסיטת פרדוסי משהד, משהד, איראן)10. ניתוח רקמות הקריבו את דגי הדגים באמצעות שמיים במים קפואים (5 חלקים קרח/1 חלקי מים, 4 ° c); להשאיר אות?…

Representative Results

נתוני הנציג עבור הפרוקסידאז הצביעת מוצגים באיור 1 ובאיור 2. אימונוהיסטוככימיים ניתוח של התפלגות שור-A ו-OX-2R בבטן של דגי מבוגרים הראו אתרי לוקליזציה שונים של OX-A ו-OX-2R ואת העליות שלהם ביטוי בתאי המעיים של ה-DIO. כתמים חומים עזים עבור שור-A נצפתה בתאים של המעי האמצע…

Discussion

הכנה לדוגמא

הכנת הדוגמה היא השלב הקריטי הראשון ב-IHC. פרוטוקול אמין מאפשר תחזוקה של מורפולוגיה של תאים, ארכיטקטורת רקמות ואנטיגניות. שלב זה מחייב איסוף רקמות נכון, קיבוע והסדר22,23. המטרה של קיבעון היא לשמר את הרקמה ולהפחית את הפעולה…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה היה נתמך על ידי Fondi Ricerca די Ateneo (FRA) 2015-2016, אוניברסיטת סאנניו.

Materials

Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216, 49-67 (1998).
  2. Haines, D. M., West, K. H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology and pathology. Veterinary Immunology and Immunopathology. , 151-156 (2005).
  3. Onul, A., et al. Application of immunohistochemical staining to detect antigen destruction as a measure of tissue damage. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (9), 683-693 (2012).
  4. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  5. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells, II: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  6. Coons, A. H., Leduc, E. H., Connolly, J. M. Studies on antibody production, I: a method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. The Journal of Experimental Medicine. 102 (1), 49-60 (1955).
  7. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry–the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
  8. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  9. Al-Hussinee, L., et al. Immunohistochemistry and pathology of multiple Great Lakes fish from mortality events associated with viral hemorrhagic septicemia virus type IVb. Diseases of Aquatic Organisms. 93 (2), 117-127 (2011).
  10. Imperatore, R., et al. Overlapping Distribution of Orexin and Endocannabinoid Receptors and Their Functional Interaction in the Brain of Adult Zebrafish. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 62 (2018).
  11. Concas, A., et al. Immunochemical Localization of GABAA Receptor Subunits in the Freshwater Polyp Hydra vulgaris. Neurochemical Research. 41 (11), 2914-2922 (2016).
  12. Mania, M., et al. Expression and distribution of leptin and its receptors in the digestive tract of DIO (diet-induced obese) zebrafish. Annals of Anatomy. , 37-47 (2017).
  13. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  14. Holmseth, S., et al. Specificity controls for immunocytochemistry: the antigen preadsorption test can lead to inaccurate assessment of antibody specificity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (3), 174-187 (2012).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  18. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  19. Cristino, L., et al. Obesity-driven synaptic remodeling affects endocannabinoid control of orexinergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), E2229-E2238 (2013).
  20. Imperatore, R., et al. Genetic deletion of monoacylglycerol lipase leads to impaired cannabinoid receptor CBR signaling and anxiety-like behavior. Journal of Neurochemistry. 135 (4), 799-813 (2015).
  21. Laperchia, C., et al. The excitatory/inhibitory input to orexin/hypocretin neuron soma undergoes day/night reorganization. Brain Structure and Function. 222 (8), 3847-3859 (2017).
  22. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Grizzle, W. E. Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. Journal of Histotechnology. 24 (3), 201-210 (2001).
  23. Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. Public Library of Science One. 6 (8), e23780 (2011).
  24. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70 (1), 12-19 (2014).
  25. Dupre, M. P., Courtade-Saidi, M. Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology. Annales de Pathologie. 32 (6), 433-437 (2012).
  26. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of Immunohistochemistry for Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Technique: From Experiments to Hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, 741-748 (2006).
  27. Giorno, R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagnostic Immunology. 2 (3), 161-166 (1984).
  28. Ramos-Vara, J. A., Saeteele, J., Howard, G. C., Kaser, M. R. Immunohistochemistry. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 273-314 (2007).
  29. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  30. Buchwalow, I., Somoloiva, V., Boecker, W., Tiemann, M. Nonspecific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Scientific Reports. 1, 28 (2011).
  31. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  32. Kalyuzhny, A. E. The dark side of the immunohistochemical moon: industry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (12), 1099-1101 (2009).
  33. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: the Histochemical Society’s standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Endocrinology. 155 (3), 676-687 (2014).
  34. Ivell, R., Teerds, K., Hoffman, G. E. Proper application of antibodies for immunohistochemical detection: antibody crimes and how to prevent them. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  35. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  36. Boi, G., Scalia, C. R., Gendusa, R., Ronchi, S., Cattoretti, G. Disaccharides Protect Antigens from Drying-Induced Damage in Routinely Processed Tissue Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (1), 18-31 (2016).
  37. Curran, R. C., Gregory, J. Demonstration of immunoglobulin in cryostat and paraffin sections of human tonsil by immunofluorescence and immunoperoxidase techniques. Effects of processing on immunohistochemical performance of tissues and on the use of proteolytic enzymes to unmask antigens in sections. Journal of Clinical Pathology. 31 (10), 974-983 (1978).
  38. O’Hurley, G., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8 (4), 783-798 (2014).
  39. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  40. Mayersbach, H. V. Principles and limitations of immunohistochemical methods. Journal of Royal Microscopical Society. 87 (2), 295-308 (1967).
  41. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: from experiments to hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (2), 105-109 (2007).
  42. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  43. Mölne, J., Breimer, M. E., Svalander, C. T. Immunoperoxidase versus immunofluorescence in the assessment of human renal biopsies. American Journal of Kidney Diseases. 45 (4), 674-683 (2005).
  44. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  45. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. , 1926304 (2017).
  46. Xie, R., et al. Factors influencing the degradation of archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (4), 356-365 (2011).
  47. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  48. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques–illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17 (12), 14067-14090 (2012).
  49. Marks, K. M., Nolan, G. P. Chemical labeling strategies for cell biology. Nature Methods. 3 (8), 591-596 (2006).

Tags

Keywords: ImmunohistochemistryImmunoperoxidaseImmunofluorescenceZebrafishOrexinEndocannabinoid ReceptorsCryosectioningBlockingPrimary AntibodiesIncubation
check_url/kr/59308?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Imperatore, R., D’Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image