JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Выявление ортексин и эндоканнабиноидных рецепторов у взрослых зебрафиш с использованием иммунопероксидаза и иммунофлуоресценции Методы

Published: June 25, 2019
doi:
10.3791/59308
, , , ,
1Department of Sciences and Technologies (DST),University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group,Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions,University of Naples Federico II

Summary

Представлены протоколы для иммуногистохимической характеристики и локализации пептида орексина, рецепторов орексина, и эндоканнабиноидных рецепторов в кишечнике и мозге нормального и диетического ожирения (DIO) взрослых моделей зебры с использованием моделей взрослых зебры иммуноперисидаза и двойные иммунофлуоресценции методы.

Abstract

Иммуногистохимия (IHC) является высокочувствительным и специфическим методом, участвующим в обнаружении целевых антигенов в секциях тканей с помеченными антителами. Это многоступенчатый процесс, в котором оптимизация каждого шага имеет решающее значение для получения оптимального конкретного сигнала. С помощью IHC можно обнаружить распределение и локализацию конкретных биомаркеров, раскрывая информацию об эволюционной консервации. Кроме того, IHC позволяет понимать экспрессии и распределение изменений биомаркеров в патологических условиях, таких как ожирение. IHC, в основном метод иммунофлуоресценции, может быть использован во взрослых зебры для обнаружения организации и распределения филогенетически сохраненных молекул, но стандартный протокол IHC не estasblished. Orexin и эндоканнабиноид две высоко консервированные системы, участвующие в борьбе с потреблением пищи и патологии ожирения. Здесь представлены протоколы, используемые для получения информации о пептид орексина (OXA), orexin рецептор (OX-2R), и каннабиноидных рецепторов (CB1R) локализации и распределения в кишечнике и мозге нормальной и диеты индуцированной ожирением (DIO) взрослых моделей зебры. Также описаны методы иммунопероксидазы и двойной иммунофлуоресценции, а также подготовка реагентов, фиксация, парафина-встраивание, криозащита ткани зебры и подготовка к эндогенной активности-блокированию шага и фона противопоставить. Полный набор параметров получен из предыдущих экспериментов IHC, с помощью которых мы показали, как иммунофлуоресценция может помочь с пониманием OXs, OX-2R и CB1R распределения, локализации и сохранения экспрессии у взрослых зебры Тканей. Полученные изображения с высокой интенсивностью сигнала привели к подтверждению того, что зебрафиш подходит для моделей животных для иммуногистохимических исследований распределения, локализации и эволюционного сохранения конкретных биомаркеров в физиологических и патологических состояний. Представленные здесь протоколы рекомендуются для экспериментов IHC у взрослых зебры.

Introduction

Иммуногистохимия (IHC) является устоявшейся классический метод, используемый для выявления клеточных или тканевых компонентов (антигенов) антиген-антитела взаимодействия1,2. Он может быть использован для определения локализации и распределения целевых биомолекул в ткани. IHC использует иммунологические и химические реакциидля обнаружения антигенов в разделах тканей 3. Основными маркерами, используемыми для визуализации антиген-антител взаимодействия включают флуоресцентные красители (иммунофлуоресценция) и фермент-субстрат цветовых реакций (иммунопероксидаза), как сопряжены с антителами4. С помощью микроскопического наблюдения можно определить локализацию маркированной ткани, что примерно соответствует локализации целевого антигена в ткани.

Существуют два метода флуоресцентных или хромогенных реакций для обнаружения белка: метод прямого обнаружения, в котором конкретное первичное антитело прямо помечено; и косвенный метод обнаружения, в котором первичное антитело неконъюгировано, в то время как вторичное антитело носит этикетку5,6,7. Косвенный метод имеет некоторые преимущества, которые в основном его усиление сигнала. Кроме того, в отличие от других молекулярных и клеточных методов, с иммунофлуоресценцией, можно визуализироватьраспределение, локализацию и коэкспрессию двух или более белков, дифференциально выраженных в клетках и тканях 7. Выбор используемого метода обнаружения зависит от экспериментальных деталей.

На сегодняшний день IHC широко используется в фундаментальных исследованиях как мощный и важный инструмент для понимания распределения и локализации биомаркеров и общего профилирования различных белков в биологических тканях от человека до беспозвоночных8, 9 До 9 , 10 Лет , 11. Техника помогает отображать карту экспрессии белка в большом количестве нормальных и измененных органов животных и различных типов тканей, показывая возможное вниз или вверх-регуляции экспрессии индуцированных физиологических и патологических изменений. IHC является высокочувствительным методом, который требует точности и правильного выбора методов для получения оптимальных результатов12. Прежде всего, многие различные факторы, такие как фиксация, кросс-реактивность, извлечение антигена и чувствительность антител могут привести к ложноположительным и ложным негативным сигналам13. Выбор антител является одним из наиболее важных шагов в IHC и зависит от антигена специфичность и его сродство к белка и видов под следствием7.

Недавно мы оптимизировали метод IHC для обнаружения членов орексина/гипокретина и эндоканнабиноидов во взрослой ткани зебры. Мы сосредоточились главным образом на фиксации, встраивание тканей с использованием двух различных подходов, секции и монтажа (которые могут повлиять на разрешение и детализацию во время микроскопического анализа), а также блокирование (для предотвращения ложных срабатываний и уменьшения фона)14. Другими важными характеристиками являются специфика антител и избирательность и воспроизводимость отдельных протоколов IHC. Ключом к обеспечению специфики антител является использование отрицательного контроля (в том числе никаких первичных антител или тканей, которые, как известно, не выражают целевых белков), а также положительный контроль (в том числе ткани, которая, как известно, выражают целевые белки)15 . Выбор антител для IHC производится на основе их видовой специфичности (вероятность того, что они реагируют с антигеном интереса) и антиген-антитела связывающих систем обнаружения, который используется4,5,6 ,7. В случае иммунопероксидазы цвет реакции определяется отбором осажденного хромогена, обычно диаминобензидина (коричневого)16. С другой стороны, яmmunofluorescence использует антитела, конъюгированные с фторфором, чтобы визуализировать экспрессию белка в замороженных секциях тканей и позволяет легко анализировать несколько белков по отношению к системе обнаружения хромогенных 5 , 7.

В методе иммунопероксидазы вторичное антитело спрягается с биотином, молекулой связующего, способной завербовать хромогенную молекулу репортера (Avidin-biotin complex (ABC) “, что приводит к усилению сигнала окрашивания. С помощью метода репортера ABC, фермент пероксидазы реагирует с 3,3′-диаминобензидин (DAB), производя интенсивно коричневого цвета окрашивания, где фермент связывается со вторичным антителом, которые затем могут быть проанализированы с обычным световым микроскопом. ABC окрашивания, из-за высокой сродство авидина для биотина, производит быструю и оптимальную реакцию, с несколькими вторичными антителами прилагается к месту первичной реактивности антитела. Этот хромогенный метод обнаружения позволяет денситометрический анализ сигнала, обеспечивая полуколичественные данные на основе корреляции уровня коричневого сигнала с уровнями экспрессии белка18.

С иммунофлюоресценции методы, одновременное обнаружение нескольких белков возможно из-за способности различных флюорохромов излучать свет на уникальных длинах волн, но важно тщательно выбирать фторхромы, чтобы свести к минимуму спектральные перекрытия 5. Кроме того, использование первичных антител у различных видов хозяев сводит к минимуму трудности, связанные с перекрестной реактивностью. В этом случае каждый специфический вид вторичных антител распознает только один тип первичных антител. Флуоресцентные репортеры представляют собой небольшие органические молекулы, в том числе коммерческие производные, такие как красители Alexa Fluor.

Многие модели животных используются для понимания конкретных физиологических и патологических состояний. На сегодняшний день установлено, что многие метаболические пути сохраняются в течение эволюции. Таким образом, IHC исследований в модельных организмов, таких как зебрафиш может обеспечить понимание генезиса и поддержания патологических и непатологических условий17. Целью настоящего доклада является иллюстрация протоколов IHC, которые могут быть выполнены на ткани взрослых зебры и использованы для получения подробных изображений распределения и локализации OXA, OX-2R и CB1R на периферийных и центральных уровнях. Также сообщается о протоколах применения двух основных косвенных методов IHC в периферических и центральных тканях взрослых зебр. Описанный является косвенным методом, который позволяет усиливать сигнал в тех случаях, когда вторичное антитело спрягается с флуоресцентным красителем (метод иммунофлуоресценции) или ферментным репортером (метод иммунопероксидазы). Как хромогенные, так и флуоресцентные методы обнаружения обладают преимуществами и недостатками. В этом протоколе сообщается об использовании IHC, главным образом иммунофлуоресценции, у взрослых зебр, модели животных, широко используемой для изучения систем, которые эволюционно сохраняются в различных физиологических и патологических условиях.

Protocol

1. Протокол иммунопероксидаза ПРИМЕЧАНИЕ: Зебрафиш были получены профессором Омид Сафари (Департамент рыболовства, факультет природных ресурсов и окружающей среды, Университет Фердоуси в Мешхиде, Мешхад, Иран)10. Рассечение тканей Пожерт?…

Representative Results

Репрезентативные данные для окрашивания иммунопероксидаза показаны на рисунке 1 и рисунке2. Иммуногистохимический анализ дистрибуции OX-A и OX-2R в кишечнике взрослых зебр ы показали различные места локализации OX-A и OX-2R и их увеличение экспрессии в клетках …

Discussion

Подготовка образцов

Подготовка образцов является первым критическим шагом в IHC. Надежный протокол позволяет обеспечить содержание клеточной морфологии, архитектуры тканей и антигенности. Этот шаг требует правильного сбора тканей, фиксации и секции<sup class="xr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Фонди Ricerca ди Ateneo (FRA)2015-2016, Университет Саннио.

Materials

Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216, 49-67 (1998).
  2. Haines, D. M., West, K. H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology and pathology. Veterinary Immunology and Immunopathology. , 151-156 (2005).
  3. Onul, A., et al. Application of immunohistochemical staining to detect antigen destruction as a measure of tissue damage. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (9), 683-693 (2012).
  4. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  5. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells, II: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  6. Coons, A. H., Leduc, E. H., Connolly, J. M. Studies on antibody production, I: a method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. The Journal of Experimental Medicine. 102 (1), 49-60 (1955).
  7. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry–the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
  8. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  9. Al-Hussinee, L., et al. Immunohistochemistry and pathology of multiple Great Lakes fish from mortality events associated with viral hemorrhagic septicemia virus type IVb. Diseases of Aquatic Organisms. 93 (2), 117-127 (2011).
  10. Imperatore, R., et al. Overlapping Distribution of Orexin and Endocannabinoid Receptors and Their Functional Interaction in the Brain of Adult Zebrafish. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 62 (2018).
  11. Concas, A., et al. Immunochemical Localization of GABAA Receptor Subunits in the Freshwater Polyp Hydra vulgaris. Neurochemical Research. 41 (11), 2914-2922 (2016).
  12. Mania, M., et al. Expression and distribution of leptin and its receptors in the digestive tract of DIO (diet-induced obese) zebrafish. Annals of Anatomy. , 37-47 (2017).
  13. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  14. Holmseth, S., et al. Specificity controls for immunocytochemistry: the antigen preadsorption test can lead to inaccurate assessment of antibody specificity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (3), 174-187 (2012).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  18. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  19. Cristino, L., et al. Obesity-driven synaptic remodeling affects endocannabinoid control of orexinergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), E2229-E2238 (2013).
  20. Imperatore, R., et al. Genetic deletion of monoacylglycerol lipase leads to impaired cannabinoid receptor CBR signaling and anxiety-like behavior. Journal of Neurochemistry. 135 (4), 799-813 (2015).
  21. Laperchia, C., et al. The excitatory/inhibitory input to orexin/hypocretin neuron soma undergoes day/night reorganization. Brain Structure and Function. 222 (8), 3847-3859 (2017).
  22. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Grizzle, W. E. Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. Journal of Histotechnology. 24 (3), 201-210 (2001).
  23. Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. Public Library of Science One. 6 (8), e23780 (2011).
  24. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70 (1), 12-19 (2014).
  25. Dupre, M. P., Courtade-Saidi, M. Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology. Annales de Pathologie. 32 (6), 433-437 (2012).
  26. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of Immunohistochemistry for Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Technique: From Experiments to Hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, 741-748 (2006).
  27. Giorno, R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagnostic Immunology. 2 (3), 161-166 (1984).
  28. Ramos-Vara, J. A., Saeteele, J., Howard, G. C., Kaser, M. R. Immunohistochemistry. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 273-314 (2007).
  29. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  30. Buchwalow, I., Somoloiva, V., Boecker, W., Tiemann, M. Nonspecific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Scientific Reports. 1, 28 (2011).
  31. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  32. Kalyuzhny, A. E. The dark side of the immunohistochemical moon: industry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (12), 1099-1101 (2009).
  33. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: the Histochemical Society’s standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Endocrinology. 155 (3), 676-687 (2014).
  34. Ivell, R., Teerds, K., Hoffman, G. E. Proper application of antibodies for immunohistochemical detection: antibody crimes and how to prevent them. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  35. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  36. Boi, G., Scalia, C. R., Gendusa, R., Ronchi, S., Cattoretti, G. Disaccharides Protect Antigens from Drying-Induced Damage in Routinely Processed Tissue Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (1), 18-31 (2016).
  37. Curran, R. C., Gregory, J. Demonstration of immunoglobulin in cryostat and paraffin sections of human tonsil by immunofluorescence and immunoperoxidase techniques. Effects of processing on immunohistochemical performance of tissues and on the use of proteolytic enzymes to unmask antigens in sections. Journal of Clinical Pathology. 31 (10), 974-983 (1978).
  38. O’Hurley, G., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8 (4), 783-798 (2014).
  39. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  40. Mayersbach, H. V. Principles and limitations of immunohistochemical methods. Journal of Royal Microscopical Society. 87 (2), 295-308 (1967).
  41. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: from experiments to hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (2), 105-109 (2007).
  42. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  43. Mölne, J., Breimer, M. E., Svalander, C. T. Immunoperoxidase versus immunofluorescence in the assessment of human renal biopsies. American Journal of Kidney Diseases. 45 (4), 674-683 (2005).
  44. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  45. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. , 1926304 (2017).
  46. Xie, R., et al. Factors influencing the degradation of archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (4), 356-365 (2011).
  47. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  48. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques–illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17 (12), 14067-14090 (2012).
  49. Marks, K. M., Nolan, G. P. Chemical labeling strategies for cell biology. Nature Methods. 3 (8), 591-596 (2006).

Tags

Keywords: ImmunohistochemistryImmunoperoxidaseImmunofluorescenceZebrafishOrexinEndocannabinoid ReceptorsCryosectioningBlockingPrimary AntibodiesIncubation
check_url/kr/59308?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Imperatore, R., D’Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image