Identificación de receptores de orexina y endocannabinoides en peces cebra adultos mediante métodos de inmunoperoxidasa e inmunofluorescencia

Summary

Aquí se presentan los protocolos para la caracterización inmunohistoquímica y la localización del péptido de orexina, los receptores de orexina y los receptores endocannabinoides en el intestino y los cerebros de los modelos de pez cebra adultos normales e inducidos por la dieta (DIO) utilizando modelos de pez cebra adultos que utilizan modelos de pez cebra adultos que utilizan modelos de pez cebra adultos que utilizan modelos de pez cebra adultos que utilizan modelos de pez cebra adultos normales e inducidos por la dieta (DIO) utilizando modelos de pez cebra adulto sin métodos de inmunoperixidasa y doble inmunofluorescencia.

Abstract

La inmunohistoquímica (IHC) es una técnica altamente sensible y específica implicada en la detección de antígenos diana en secciones tisulares con anticuerpos etiquetados. Es un proceso de varios pasos en el que la optimización de cada paso es crucial para obtener la señal específica óptima. A través de IHC, se puede detectar la distribución y localización de biomarcadores específicos, revelando información sobre la conservación evolutiva. Además, iHC permite la comprensión de los cambios de expresión y distribución de biomarcadores en condiciones patológicas, como la obesidad. IHC, principalmente la técnica de inmunofluorescencia, se puede utilizar en peces cebra adultos para detectar la organización y distribución de moléculas filogenéticamente conservadas, pero un protocolo IHC estándar no es estasblished. Orexin y endocannabinoides son dos sistemas altamente conservados involucrados en el control de la ingesta de alimentos y la patología de la obesidad. Aquí se informan protocolos utilizados para obtener información sobre el péptido de orexina (OXA), el receptor de orexina (OX-2R) y la localización y distribución del receptor cannabinoide (CB1R) en el intestino y el cerebro de modelos de pez cebra adultos con efectos obesos normales e inducidos por la dieta (DIO). También se describen los métodos de inmunoperoxidasa y doble inmunofluorescencia, así como la preparación de reactivos, fijación, incrustación de parafina y crioprotección del tejido de peces cebra y preparación para un paso y antecedentes endógenos que bloquean la actividad Contratinción. El conjunto completo de parámetros se obtiene de experimentos anteriores de IHC, a través de los cuales hemos demostrado cómo la inmunofluorescencia puede ayudar con la comprensión de los QUIR, LA distribución, localización y conservación de la expresión de los ORX, OX-2R y CB1R en el pez cebra adulto Tejidos. Las imágenes resultantes con intensidad de señal muy específica llevaron a la confirmación de que el pez cebra son modelos animales adecuados para estudios inmunohistoquímicos de distribución, localización y conservación evolutiva de biomarcadores específicos en condiciones fisiológicas y patológicas. Los protocolos presentados aquí se recomiendan para experimentos IHC en peces cebra adultos.

Introduction

La inmunohistoquímica (IHC) es una técnica clásica bien establecida utilizada para identificar componentes celulares o tisulares (antígenos) por interacción antígeno-anticuerpo^1,2. Se puede utilizar para identificar la localización y distribución de biomoléculas diana dentro de un tejido. IHC utiliza reacciones inmunológicas y químicas para detectar antígenos en las secciones³del tejido. Los principales marcadores utilizados para la visualización de interacciones antígeno-anticuerpos incluyen distículos fluorescentes (inmunofluorescencia)y reacciones de color enzima-sustrato (inmunoperoxidasa), ambos conjugados con anticuerpos 4. El uso de la observación microscópica es posible determinar la localización del tejido etiquetado, que corresponde aproximadamente a la localización del antígeno objetivo en el tejido.

Existen dos métodos para que las reacciones fluorescentes o cromogénicas detecten proteínas: el método de detección directa, en el que el anticuerpo primario específico se etiqueta directamente; y el método de detección indirecta, en el que el anticuerpo primario no se conjuga mientras que el anticuerpo secundario lleva la etiqueta^5,6,7. El método indirecto tiene algunas ventajas, que es principalmente su amplificación de señal. Además, a diferencia de otras técnicas moleculares y celulares, con inmunofluorescencia, es posible visualizar ladistribución, localización y coexpresión de dos o más proteínas expresadas diferencialmente dentro de las células y tejidos 7. La elección del método de detección utilizado depende de los detalles experimentales.

Hasta la fecha, IHC es ampliamente utilizado en la investigación básica como una herramienta poderosa y esencial para entender la distribución y localización de biomarcadores y el perfilado general de diferentes proteínas en el tejido biológico desde el ser humano hasta los invertebrados^{8, 9 , 10 , 11}. La técnica ayuda a mostrar un mapa de expresión proteica en un gran número de órganos animales normales y alterados y diferentes tipos de tejidos, mostrando una posible regulación hacia abajo o hacia arriba de la expresión inducida por cambios fisiológicos y patológicos. IHC es una técnica altamente sensible que requiere precisión y la elección correcta de métodos para obtener resultados óptimos¹². En primer lugar, muchos factores diferentes como la fijación, la reactividad cruzada, la recuperación de antígenos y la sensibilidad de los anticuerpos pueden conducir a señales falsas positivas y falsas negativas¹³. La selección de los anticuerpos es uno de los pasos más importantes en IHC y depende de la especificidad del antígeno y su afinidad con la proteína y las especies bajo investigación⁷.

Recientemente, hemos optimizado la técnica IHC para detectar miembros de sistemas de orexina/hipocretina y endocannabinoides en el tejido adulto de pez cebra. Nos hemos centrado principalmente en la fijación, la integración de tejidos utilizando dos enfoques diferentes, la sección y el montaje (que pueden afectar la resolución y el detalle durante el análisis microscópico), y el bloqueo (para prevenir falsos positivos y reducir el fondo)¹⁴. Otras características importantes son la especificidad de anticuerpos y la selectividad y reproducibilidad de los protocolos IHC individuales. La clave para proporcionar especificidad de anticuerpos es el uso de controles negativos (incluyendo ningún anticuerpo primario o tejido que se sabe que no expresa las proteínas diana) así como controles positivos (incluyendo tejido que se sabe que expresa las proteínas diana)¹⁵ . La selección de anticuerpos para IHC se realiza en función de su especificidad de especie (la probabilidad con la que reaccionan con el antígeno de interés) y los sistemas de detección de unión antígeno-anticuerpo que se utiliza^{4,5,6 ,7}. En el caso de la inmunoperoxidasa, el color de la reacción se determina mediante la selección del cromógeno precipitante, generalmente diaminobenzidina (marrón)^16. Por otro lado, immunofluorescence utiliza anticuerpos conjugados con un fluoróforo para visualizar la expresión de proteínas en secciones de tejido congelado y permite un fácil análisis de múltiples proteínas con respecto al sistema de detección cromogénica ^{5 , 7}.

En la técnica de la inmunoperoxidasa, el anticuerpo secundario se conjuga con la biotina, una molécula de vinculador capaz de reclutar una molécula de reportero cromogénico [complejo de biotina de avidina (ABC)], lo que conduce a la amplificación de la señal de tinción. Con el método de reportero ABC, la enzima peroxidasa reacciona con 3,3′-diaminobenzidina (DAB), produciendo una tinción intensamente de color marrón donde la enzima se une al anticuerpo secundario, que luego puede ser analizado con un microscopio de luz ordinario. La tinción ABC, debido a la alta afinidad de la avidina por la biotina, produce una reacción rápida y óptima, con pocos anticuerpos secundarios unidos al sitio de la reactividad primaria de anticuerpos. Este método de detección cromogénica permite el análisis densitométrico de la señal, proporcionando datos semicuantitativos basados en la correlación de los niveles de señal marrón con los niveles de expresión de proteínas^18.

Con las técnicas de inmunofluorescencia, la detección simultánea de múltiples proteínas es posible debido a la capacidad de diferentes fluorocromos para emitir luz a longitudes de onda únicas, pero es importante elegir los fluorocromos cuidadosamente para minimizar la superposición ^{espectral 5}. Además, el uso de anticuerpos primarios en diferentes especies anfitrionas minimiza las dificultades relativas a la reactividad cruzada. En este caso, cada anticuerpo secundario específico de la especie reconoce sólo un tipo de anticuerpo primario. Los reporteros fluorescentes son moléculas orgánicas pequeñas, incluyendo derivados comerciales, como los tintes Alexa Fluor.

Muchos modelos animales se utilizan para entender condiciones fisiológicas y patológicas particulares. Hasta la fecha, se ha establecido que muchas vías metabólicas se conservan a lo largo de la evolución. Por lo tanto, los estudios de IHC en organismos modelo como el pez cebra pueden proporcionar información sobre la génesis y el mantenimiento de las condiciones patológicas y no patológicas^17. El objetivo de este informe es ilustrar los protocolos IHC que se pueden realizar en el tejido adulto de pez cebra y utilizarse para obtener imágenes detalladas de la distribución y localización de OXA, OX-2R y CB1R a nivel periférico y central. También se informa nifiquen los protocolos para la aplicación de dos métodos indirectos principales de IHC en los tejidos periféricos y centrales del pez cebra adulto. Se describe el método indirecto, que permite la amplificación de la señal en los casos en que un anticuerpo secundario se conjuga con un tinte fluorescente (método de inmunofluorescencia) o un reportero enzimático (método de inmunoperoxidasa). Los métodos de detección cromogénicos y fluorescentes poseen ventajas y desventajas. En este protocolo se informa el uso de IHC, principalmente inmunofluorescencia, en el pez cebra adulto, un modelo animal ampliamente utilizado para estudiar sistemas que se conservan evolutivamente en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas.

Protocol

1. Protocolo de inmunoperoxidasa NOTA: El pez cebra fue obtenido por el Prof. Omid Safari (Departamento de Pesca, Facultad de Recursos Naturales y Medio Ambiente, Universidad Ferdowsi de Mashhad, Mashhad, Irán)10. Disección de tejidos Sacrificar el pez cebra por inmersión en agua helada (5 partes de hielo/1 parte de agua, 4 oC); dejarlos hasta el cese de todo movimiento para asegurar la muerte por hipoxia. Retire rápid…

Representative Results

Los datos representativos de la tinción de la inmunoperoxidasa se muestran en la Figura 1 y la Figura 2. El análisis inmunohistoquímico de la distribución ox-A y OX-2R en el intestino del pez cebra adulto mostró diferentes sitios de localización de OX-A y OX-2R y sus aumentos en la expresión en las células intestinales del pez cebra DIO. Se observó una tinción marrón intensa para OX-A en las células del intestino medial y anterior (Figura<strong clas…

Discussion

Preparación de muestras

La preparación de muestras es el primer paso crítico en IHC. Un protocolo fiable permite el mantenimiento de la morfología celular, la arquitectura de los tejidos y la antigenicidad. Este paso requiere la correcta recolección de tejido, fijación y sección^22,23. El propósito de la fijación es preservar el tejido y reducir la acción de las enzimas tisulares o microorganismos. En p…

Materials

Anti CB1	Abcam	ab23703
Anti OX-2R	Santa Cruz	sc-8074
Anti-OXA	Santa Cruz	sc8070
Aquatex	Merck	1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat	Vector Lab	BA-5000
citric acid	Sigma Aldrich	251275
Confocal microscope	Nikon	Nikon Eclipse Ti2
Cryostat	Leica Biosystem	CM3050S
DAPI	Sigma Aldrich	32670
Digital Camera	Leica Biosystem	DFC320
Digital Camera for confocal microscope	Nikon	DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A21207
Ethanol absolute	VWR	20,821,330
Frozen section compound	Leica Biosystem	FSC 22 Frozen Section Media
H2O2	Sigma Aldrich	31642
HCl	VWR	20,252,290
ImmPACT DAB	Vector lab	SK4105
Microscope	Leica Biosystem	DMI6000
Microtome	Leica Biosystem	RM2125RT
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
NaH2PO4H2O	Sigma Aldrich	S9638
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
Normal Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663
Normal Rabbit Serum	Vector lab	S-5000
paraffin wax	Carlo Erba	46793801
Paraphormaldeyde	Sigma Aldrich	P6148
sodium citrate dihydrate	Sigma Aldrich	W302600
Triton X-100	Fluka Analytical	93420
Trizma	Sigma Aldrich	T1503
VectaStain Elite ABC Kit	Vector lab	PK6100
Xylene Pure	Carlo Erba	392603