확산의 분석 및 형광 현미경 검사 법에 의해 수용 체 막의 클러스터 크기에 대 한 프로토콜을 처리 하는 이미지
Summary
여기, 우리는 확산 계수, 형광 현미경 검사 법에 의해 감지 하는 단일 입자의 모션 및 클러스터 크기의 종류의 정량적 인 평가 허용 하는 이미지 분석을 추적 하는 단일 입자에 대 한 프로토콜을 제시.
Abstract
비디오 시퀀스에 그들의 궤도의 후부 분석 추적 입자 요즘 많은 생물학 연구에서 일반적인 작업입니다. 모델 클러스터 세포 막 수용 체의 분석을 사용 하 여, 피지 (ImageJ) 및 Matlab 루틴을 사용 하 여이 이미지 분석 작업에 대 한 자세한 프로토콜 소개: 1) 관심 영역을 정의 하 고 마스크;이 지역에 맞게 디자인 2) 형광 현미경 동영상; 입자 추적 3) 선택 된 트랙의 확산 및 강도 특성 분석. 확산 계수의 정량 분석, 모션, 및 클러스터 크기의 유형 형광 현미경으로 얻은 이미지 처리 하며 객관적으로 입자 역학과 수정 결과 확인 하는 유용한 도구 환경 조건입니다. 이 문서에서는 이러한 기능 분석에 대 한 상세한 프로토콜 선물이. 설명 하는 방법을 여기 뿐만 아니라 단일 분자 추적 탐지를 허용 하지만 측면 확산 세포 막에서 매개 변수 추정 자동화, 궤적의 유형을 분류 하 고 따라서 극복 하는 완전 한 분석을 수는 세포 막에서 그것의 전체 궤도에 자리 크기 측정에 어려움
Introduction
막 단백질 지질 bilayer에 포함 된 열 확산으로 지속적인 운동에 있습니다. Intermolecular 상호 작용 올리고 단위체에서 크기에서 변화 하 고 신호 복합물의 안정성에 영향을 단지의 형성으로 그들의 역학 세포 응답 통제에 필수적입니다. 단백질 역학을 제어 하는 메커니즘을 elucidating 따라서 세포 생물학, 신호 전달 경로 이해 하 고 예기치 않은 셀 기능을 식별 하는 데 필요한 새로운 도전 이다.
일부 광 방법은 개발 되었다1셀 생활에 이러한 상호 작용을 공부 하. 이러한 가운데, 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 검사 법, 1980 년대 초에 개발 또는 세포 막2근처 매우 분자 상호 작용의 연구를 수 있습니다. 공부 하 고 살아있는 세포에 TIRF 데이터에서 가져온 막 단백질 궤적의 동적 매개 변수, 단일 입자 추적 방법 (SPT)가 필요 합니다. 여러 알고리즘이 사용할 수 있습니다, 있지만 우리 현재 Jaqaman 외.3 는 입자 결과 트랙을 연결 하려면 연속 프레임 사이 연결 하 여 입자 모션이 조밀한 입자 필드에 의해 그 사용 완전 한 궤도 (임시 입자 실종)에 세그먼트. 소프트웨어를 병합 하 고 그 결과 집계 및 분리 이벤트3에서 분할 입자를 캡처합니다. 이 소프트웨어의 출력 데이터 중 하나는 각 프레임에서 그들의 X 및 Y 위치를 정의 하 여 전체 궤적에 따라 입자의 탐지 이다.
일단 입자 감지, 우리 짧은 timelag 확산 계수 (D1-4),45를 확인 하려면 다른 알고리즘을 적용 합니다. 순간 확장 스펙트럼 (MSS)6,,78 분석을 적용 하거나 조정 곡선9제곱 변위 (MSD)의 ‘알파’ 값을 피팅, 우리도에 따라 입자 분류 궤도의 유형입니다.
형광 이미지 자리 강도 분석 필드10,11에 과학자에 대 한 공유 목표 이다. 사용 되는 가장 일반적인 알고리즘은 소위 수와 밝기. 이 메서드는 그럼에도 불구 하 고 모바일 분수에서 입자에 올바른 프레임으로 프레임 강도 감지를 허용 하지 않습니다. 따라서, 이러한 입자 농도-의해-프레임을 평가 하 고 그들의 집계 상태를 결정 하는 새로운 알고리즘을 생성, 되었습니다. 각 입자의 좌표 U-Track2 소프트웨어3를 사용 하 여 감지, 일단 정의 강도 각 프레임에 완전 한 궤도 통해 각 프레임에서 셀 배경은 고려도 합니다. 이 소프트웨어 자리 강도 및 셀 배경 결정 하는 다른 가능성을 제공 하 고, 입자 감지 (클러스터 크기)에 있는 단백질의 대략적인 수를 계산 합니다 참조로 알려진된 단위체와 dimeric 단백질을 사용 하 여.
이 문서에서는 이러한 세 단계를 수행 하는 주의 가이드 설명: 1) 검색 및 U-트랙;를 사용 하 여 형광 현미경의 비디오에 따라 단일 입자 추적 2) MSS; 여 긴 궤적을 가진 입자의 움직임 (밀폐, 무료, 또는 감독)의 유형과 그 입자의 즉석 확산 계수 (D1-4) 분석 3) 각 장소에 대 한 예상된 배경 형광에 의해 수정 비디오 따라 자리 강도 측정 하는. 클러스터 크기 추정 및 photobleaching 단계 식별 수 있습니다.
이 프로토콜을 사용 하는 전문된 기술을 요구 하지 않는다 세포 배양으로 어떤 실험실에서 수행할 수 있습니다, 그리고 flow cytometry 및 현미경 검사 법. 프로토콜은 ImageJ 또는 피지 (ImageJ12배포), U-트랙3및 일부 ad hoc 만든 루틴 (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip)를 사용합니다. U-트랙 및 ad hoc 루틴 모든 호환 컴퓨터에 설치할 수 있는 Matlab을 통해 실행 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
설명된 방법을 Matlab 함께 어떤 이전 경험을 필요 없이 수행 하기 쉽습니다. 그러나, Matlab 루틴 매우 다른 명령의 명칭 및 프로그램에 의해 고용 된 다른 폴더의 지역화와 정확성이 필요 합니다. 추적에서 분석 루틴 (3 단계), 여러 개의 매개 변수를 수정할 수 있습니다. “설정 가우스 혼합 모델 피팅” 창 (단계 3.8) U-트랙 비디오에 단일 입자 감지 방법을 제어 합니다. 이 피팅 가우스 혼합 모델<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 카를로 Manzo와 마리아 가르시아 Parajo 확산 계수 분석의 그들의 도움과 소스 코드에 대 한 감사입니다. 이 작품은 과학 스페인 교육부, 혁신 및 대학 (SAF 2017-82940-R)에서 교부 금에 의해 부분적으로 지원 및 기관 드 건배 카를로스 3 세 (RD12/0009/009와 RD16/0012/0006;의 RETICS 프로그램 RIER)입니다. LMM 및 JV Fundación 일반 CSIC의 COMFUTURO 프로그램에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
References
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