Billedbehandling protokol for analysen af Diffusion og Cluster størrelse af membranreceptorer af Fluorescens mikroskopi

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for enkelt partikel tracking billedanalyse, der giver mulighed for kvantitative evaluering af diffusion koefficienter, typer af motion og klynge størrelser af én partikler opdaget af Fluorescens mikroskopi.

Abstract

Partiklen tracking på en videosekvens, og de posteriore analyse af deres baner er i dag en fælles operation i mange biologiske undersøgelser. Ved hjælp af analyse af cellens membran receptor klynger som en model, vi præsenterer en detaljeret protokol for dette billede analyse opgave ved hjælp af Fiji (ImageJ) og Matlab rutiner til: 1) definere områder af interesse og designe masker tilpasset til disse regioner; 2) spore partikler i Fluorescens mikroskopi videoer; 3) analysere diffusion og intensitet egenskaber over udvalgte spor. Kvantitativ analyse af diffusion koefficienter, typer af motion, og cluster størrelse fremstillet af Fluorescens mikroskopi og billedbehandling giver et værdifuldt redskab for at objektivt bestemme partikel dynamics og konsekvenserne af ændring miljøforhold. I denne artikel præsenterer vi detaljerede protokoller til analyse af disse funktioner. Metoden beskrevet her ikke kun giver mulighed for enkelt-molekyle inddeling opdagelse, men også automatiserer estimering af lateral diffusion parametre på cellemembranen, klassificerer typen bane og giver mulighed for komplet analyse således at overvinde den vanskeligheder med at kvantificere spot størrelse over dens hele bane på cellemembranen.

Introduction

Membranproteiner indlejret i lipid tolagede er i kontinuerlig bevægelse på grund af termisk diffusion. Deres dynamics er vigtigt at regulere celle svar, da intermolekylære vekselvirkninger tillader dannelsen af komplekser, der varierer i størrelse fra monomerer til oligomerer og påvirke stabiliteten i signalering komplekser. Belyse de mekanismer, der styrer protein dynamics er således en ny udfordring i cellebiologi, nødvendigt at forstå signaltransduktionsveje og identificere uventede cellefunktioner.

Nogle optiske metoder er blevet udviklet til at studere disse interaktioner i levende celler,¹. Blandt disse, total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi, udviklet i begyndelsen af 1980 ' erne, giver mulighed for undersøgelse af molekylære vekselvirkninger på eller meget nær cellemembranen². For at studere dynamiske parametre af membran protein baner fra JOHANNAS data i levende celler, er et enkelt partikel sporing metode (SPT) påkrævet. Selv om flere algoritmer er tilgængelige for det, bruger vi i øjeblikket dem udgivet af Jaqaman et al.³ , adresse partikel bevægelse heterogenitet i en tætte partikel felt ved at sammenkæde partikler mellem på hinanden følgende frames tilsluttes den resulterende spor segmenter i komplet baner (midlertidig partikel forsvinden). Softwaren indfanger partikel sammenlægning og opsplitning som følge af sammenlægning og dissociation begivenheder³. En af outputdata af denne software er påvisning af partikler langs hele bane ved at definere deres X og Y stillinger i hver ramme.

Når partikler er registreret, anvender vi forskellige algoritmer til at bestemme den korte vender diffusion koefficient (D_1-4)^4,5. Ved at anvende øjeblik skalering spektrum (MSS)^6,7,8 analyse eller ved at montere 'alpha' værdien af justering af middelværdi deplacement (MSD) til kurven⁹klassificere vi også partikler i henhold til typen bane.

Analyse af spot intensitet i fluorescens billeder er et fælles mål for forskere i felt^10,11. Den mest almindelige algoritme bruges er den såkaldte antallet og lysstyrke. Denne metode tillader alligevel ikke korrekte frame-by-frame intensitet påvisning i i partikler i den mobile fraktion. Vi har således, genereres en ny algoritme til at vurdere disse partikel intensiteter frame-by-frame og bestemme deres sammenlægning tilstand. Når koordinaterne for hver partikel er registreret ved hjælp af U-Track2 software³, definerer vi dens intensitet i hver ramme over komplet bane, også under hensyntagen til cellebaggrunden i hver ramme. Denne software tilbyder forskellige muligheder for at bestemme den spot intensitet og cellebaggrunden og ved hjælp af kendte monomere og dimerisk proteiner som referencer, beregner det omtrentlige antal proteiner i partikel opdaget (cluster størrelse).

I denne artikel vil vi beskrive en grundig guide til at udføre disse tre trin: 1) påvisning og sporing én partikler langs en video af Fluorescens mikroskopi ved hjælp af U-spor; 2) analyserer den øjeblikkelige diffusion koefficient (D_1-4) af disse partikler og typen af bevægelsen (begrænset, gratis eller styret) af partikler med lange baner af MSS; 3) måling af spot intensiteten langs videoen korrigeret af de anslåede baggrund fluorescens af hver plet. Dette giver mulighed for klynge størrelse vurdering og identifikation af photobleaching trinene.

Anvendelse af denne protokol kræver ikke specialiserede færdigheder og kan udføres på et laboratorium med cellekultur, flow flowcytometri og mikroskopi faciliteter. Protokollen bruger ImageJ eller Fiji (en distribution af ImageJ¹²), U-track³, og nogle ad hoc-lavet rutiner (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-bane og ad hoc-rutiner kørt over Matlab, som kan installeres på enhver kompatibel computer.

Protocol

1. forberedelse af biologiske prøver

1. Vokse Jurkat celler i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FCS, NaPyr og L-glutamin (komplet RPMI). Electroporate Jurkat celler (20 x 10⁶ celler/400 µL af RPMI 1640 med 10% FCS) med en monomere normal god landbrugspraksis-mærket chemokine receptor vektor (CXCR4-AcGFP, 20 μg) at tillade dens afsløring, ved hjælp af Fluorescens mikroskopi.
   Bemærk: Det er muligt at bruge andre monomere fluorescerende proteiner såsom mCherry, mScarlet, osv.
2. 24 timer efter Transfektion analysere celler i et flow forskellige til at bestemme både cellernes levedygtighed og CXCR4-AcGFP udtryk.
3. Marker celler udtrykker lav CXCR4-AcGFP niveauer af cellen sortering af normal god landbrugspraksis^lav positive celler (figur 1), lav udtryk for transfekteret receptor er krævet i TIRFM eksperimenter for at sikre enkelt partikel sporing for sporing af individuelle baner⁹.
4. Kvantificere antallet af receptorer på cellens overflade.
   Bemærk: Som et eksempel¹³, ~ 8.500-22.000 AcGFP-mærket receptorer/celle, svare til ~ 2-4,5 partikler/μm².
5. Resuspend sorteret celler i komplet RPMI og inkuberes i mindst 2 timer ved 37 ° C, 5% CO₂. Centrifugeres celler (300 x g, 5 min), og genopslemmes dem i JOHANNAS buffer (HBSS, 25 mM HEPES, 2% FCS, pH 7.3).
   1. Plade på 35 mm glas-bund microwell retter (2-3 x 10⁵ celle/parabol) belagt med fibronektin (20 μg/mL, 1 time, 37 ° C) i tilstedeværelse eller fravær af passende ligand (dvs., CXCL12, 100 nM, 1 time, 37 ° C). Inkuber celler (20 min. ved 37 ° C, 5% CO₂) før billede erhvervelse.
6. Udføre eksperimenter ved hjælp af en JOHANNAS mikroskop, udstyret med en EM-CCD kamera, et 100 x oliebestan mål (HCX PL APO 100 x / 1.46 NA) og en 488 nm diodelaser. Mikroskopet tillader temperaturkontrol og inkubering med CO₂. Lokalisere og fokusere celler med de grove og fine fokus drejeknapper, ved hjælp af lysfelt for at minimere photobleaching virkninger. Fine fokus justering i JOHANNAS mode at bruge en lavt laser intensitet, utilstrækkelig registrering af enkelt-partikel eller til at fremkalde photobleaching effekter (5% laser power, 28 μW).
7. Erhverve film (billedsekvenser) af ca. 50 s minimere tidsintervallet mellem rammer. Penetration af feltet flygtige bør være 70-90 nm af dybde. Gem de erhvervede film for hver eksperimentelle betingelse som ".lif" (video.lif).
   Bemærk: Film i den beskrevne eksempel var erhvervet på 49% ved laser power (2 mW) med en eksponeringstid på 90 ms og et tidsinterval på 98 ms, for 49 s (500 frames). Penetration af den valgte flygtige bølge var 90 nm.

2. udvælgelse af billeder og oprettelse af masker

1. Opret en ny mappe (VideoName), der skal indeholde forskellige mapper for hver serie for hver eksperimentelle tilstand (video.lif). Hver mappe indeholder en "videoSeq" for de videobilleder og en "resultater" mappen for resultaterne af analysen. Sørg for, at filstrukturen på dette tidspunkt er følgende:
   VideoName/video.lif
   VideoName/Series1/videoSeq
   VideoName/Series1/resultater
   Bemærk: Mikroskopet er forskellige .lif filer fremstillet med flere videos for hver behandling tilstand (dvs. FN, FN + SDF). "video.lif" svarer til den input.lif video fil med alle JOHANNAS film erhvervelser (serie) udføres på mikroskopet. "videoSeq" mappe indeholder den film, vi analyserer 500 frames. Mappen "resultater" vil indeholde alle filer som følge af analysen udføres. Nøjagtig nomenklatur og lokalisering af de forskellige mapper er afgørende for den korrekte funktion af algoritmerne. Navne med fed skrift på listen ovenfor er fast (dvs., de har at blive kaldt på denne måde, fordi disse er navne tomånedersperioden scripts). Navne ikke i fed kan ændres for at afspejle eksperimentet udføres.
2. Åbn TIRFM video (.lif fil) med Fiji eller ImageJ ved at trække og slippe filen på Fiji menulinje, og klik på OK for at importere lif filen ved hjælp af BioFormats (tillægs figur 1).
3. Vælg serie til at behandle og klik på OK (supplerende figur 2A). For at designe en maske til analyse af denne video, importere også et multikanalbillede med de forskellige lysopfangende (i eksemplet, serie 1 er multikanalbillede og serie 2 tilsvarende videoen). Videoen (og den multikanalbillede) bør åbne som en ImageJ stack. I eksemplet (supplerende figur 2B), billedet er til venstre og videoen er til højre.
   Bemærk: Hvis oprettelsen af en maske for video ikke er nødvendig, skal du gå til trin 2,5.
4. Oprette en maske. Oprette et enkelt billede med kanalerne nyttige for design af masken. I dette tilfælde er de interessante kanaler dem, rød, grøn og grå.
   1. Opdele kanaler fra multikanalbillede (supplerende figur 3A): Vælg billede i baren menu og klik farve | Opdele kanaler. De forskellige kanaler vises som separate billeder (supplerende figur 3B).
   2. Flette igen de tre kanaler i et enkelt billede (supplerende figur 4A): Vælg billede i baren menu og vælg farve | Flette kanaler. Vælg de rette kanaler og tryk på OK (supplerende figur 4B). En ny ikke-stablet billedet bliver genereret (supplerende figur 4 c).
   3. Synkronisere de to vinduer ved hjælp af værktøjet Synkronisere Windows (supplerende figur 5A): Vælg analyser i baren menu | Værktøjer | Synkronisere Windows. Et nyt vindue med Synkroniser billede muligheder bliver vist (supplerende figur 5B).
   4. Med de to Vinduer synkroniseret (kun video hvis der er ingen multikanalbillede forbundet), kan den samme region i både windows beskæres. Trække det pågældende område med værktøjet rektangulær markering af ImageJ flydende menu. Vælg billede i baren menu og vælg afgrøde (supplerende figur 6A). De to beskårne billeder vil vise individuelt (supplerende figur 6B).
   5. Unsynchronize både windows (supplerende figur 6B) ved at trykke på knappen Unsynchronize alle i Sync Windows manager.
5. Hvis en maske ikke er blevet oprettet som i trin 2.4, tegne region af interesse med den rektangulære markeringsværktøj ImageJ flydende menu.
6. Gemme video som en billedsekvens i mappen videoSeq under den tilsvarende video bibliotek (supplerende figur 7A): Vælg fil i bar menuen og klik gemme som | Billede sekvens... omdøbe etiketter for video-sekvens som video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (supplerende figur 7B): i navneboksen, omdøbe som video og klik på OK. Rækkefølgen skal være alene i sit register skal anvendes med succes ved U-banen.
   Bemærk: Hvis ikke designe en maske for videoen, gå til trin 2.8.
7. Designe en maske. Vælg den multikanalbillede og åbne segmentering Editor plugin (supplerende figur 8A): Vælg Plugins i baren menu og vælg segmentering | Segmentering editor. Tilføj og omdøbe segmentering som nødvendige etiketter ved at højreklikke på etiketterne af segmentering editor (supplerende figur 8B, C).
   1. Vælg det relevante markeringsværktøj i ImageJ flydende menu (her bruger frihånd), Vælg en etiket (grøn) og udforme først den yderste maske (supplerende figur 9A). Når designet, vises Tryk på + knappen i udvalg valgmulighed i Composite -vinduet, og den valgte maske på fremviseren (supplerende figur 9A). Gentag dette trin med næste etiketter (interiør, med rødt) (supplerende figur 9B).
      Bemærk: Efter at designe maske for etiketter grøn og interiør, vil udvendig maske indtage resten af billedet.
   2. Masker er kodet i billedet som regioner 0, 1, 2... efter rækkefølgen af etiketterne i vinduet RGB-etiketter. Når alle masker for de forskellige etiketter er designet, gemme masken med det samme filnavn som videoen med navnet mask.tif (supplerende figur 9 c): Vælg fil i baren menu og vælg gemme som | TIFF....
      Bemærk: De udvalgte masker vil være ansat i beregningen af diffusion koefficienter og klassificering af baner (Se trin 4.2).
8. Kontroller, at filstrukturen på dette tidspunkt er følgende:
   VideoName/video.lif
   VideoName/Series1/mask.tif
   VideoName/Series1/ videoSeq / video0000.tif
   VideoName/Series1/ videoSeq / video0001.tif
   ...
   VideoName/Series1/ videoSeq / video0499.tif
   VideoName/Series1/resultater
   Bemærk: Mask.tif er et billede med masken, som beregnet i trin 2.4 og 2.7. Video*.tiff er videoen som gemte i trin 2.6. Som ovenfor, navne i fed i oversigten ovenfor er faste, dvs., de skal hedde på denne måde, fordi disse er navne søges af scripts. Navne ikke i fed kan ændres for at afspejle eksperimentet udføres.

3. sporing partiklerne

1. Spore alle de partikler, der ses i de udvalgte videoer ved hjælp af U-banen.
2. Åbne Matlab og tilføje U-track register til stien ved hjælp af angivet sti | Tilføj med undermapper option i menuen. Gemme stien, så fremover henrettelser af Matlab U-banen er i vejen. Denne path-indstillingen skal gøres én gang.
3. Ændre arbejdsbiblioteket til den mappe, der indeholder serien der skal analyseres. Påberåbe sig U-spor ved at skrive i konsollen (supplerende figur 10) movieSelectorGUI og tryk enter. Film udvalg rude vil være anlagde (supplerende fig. 11A).
4. Tryk på knappen ny film og vises vinduet Movie oplag (supplerende fig. 11B).
5. Tryk på Tilføj kanal at vælge mappen med video (VideoName/Series1/video) og fylde film oplysninger parametre. Sætte uddata-mappe til resultaterne af U-banen til resultater (videoName/Series1/resultater).
   Bemærk: Film oplysninger parametre kan fås fra mikroskop og erhvervelse betingelser.
6. Tryk på avancerede Kanalindstillinger og udfylde de parametre, der vedrører erhvervelse. Se værdierne af parametrene i eksemplet (supplerende figur 11C).
7. Tryk på Gem i vinduet avancerede Kanalindstillinger og gemme på vinduet Movie oplag . Programmet vil bede om bekræftelse af at skrive den fil kaldet movieData.mat på mappen resultater . Bekræfte.
8. Når du har oprettet filmen, tryk på Fortsæt i vinduet film udvalg. U-bane vil spørge om objekttypen, der skal analyseres. Vælg enkelt-partikler (supplerende figur 12). Kontrolpanel vinduet vises (supplerende fig. 13A).
   1. Vælg det første skridt trin 1: registrering af og tryk på indstilling. Vinduet Indstilling Gaussisk blanding-Model Fitting vises (supplerende Figur 13B). I eksemplet med er "Alpha værdi ved sammenligning med lokale baggrund" indstillet til 0,001 og "Rullende-vinduet tid gennemsnit" til 3 (supplerende Figur 13B).
   2. Tryk på Anvend i vinduet Indstillinger Gaussisk blanding-Model Fitting og køre i Kontrolpanel. Med konfiguration i supplerende Figur 13kører kun registrering skridt. Dette trin tager et par (2-5) minutter. Tjek resultaterne ved at trykke på knappen resultat for trin 1 (afsløring, supplerende Figur 14).
      Bemærk: Som vist ovenfor, viser filmen røde cirkler på de detekterede partikler. Hvis der ingen rød cirkel, har så dette trin ikke fungeret korrekt.
9. Udføre identifikation af spor, det vil sige, fusionerende partikler blev fundet i det forrige trin til numre, der spænder over flere rammer. Dette er den trin 2: Tracking af U-spor, hvis indstillinger skal defineres som vist i Supplerende figur 15A-C. Trin 2 omkostningerne funktion indstillinger for ramme til ramme forbinder og hul lukker, sammenlægning og opdeling i eksemplet er vist i supplerende figur 15B og C, henholdsvis.
10. Efter indstilling af parametre til trin 2, tryk køre i Kontrolpanel og kører kun trin 2 (supplerende Figur 16).
11. Udføre spor analyse, trin 3. Definer indstillingerne, som vist i supplerende figur 17 (højre panel). Tryk derefter på Anvend i panelet af indstilling-bevægelse analyse, og køre i kontrol Panel-U-banen. Dette trin tager et par sekunder.
12. Bekræfte med knappen resultat for trin 3, processen korrekt har identificeret alle sporene. For at gøre det, skal du klikke på Vis nummer i vinduet filmindstillinger og kontrollere indramme af indramme at hvert spor er blevet korrekt identificeret (supplerende figur 18). Manuelt anmærke disse partikler, der ikke er sand partikler.
    Bemærk: Hvis denne manuel udvælgelse ikke er gjort, kan en svagere automatisk valg udføres senere når diffusion koefficient beregnes (Se trin 4).

4. beregning af Diffusion koefficienter og klassificering af baner

1. Sørg for at alle scripts er gældende fra mappen, hvor videoen at blive analyseret (i eksemplet, VideoName/Serie1).
2. Læs alle baner for at beregne diffusion koefficienterne ved udstedelse i Matlab konsollen kommandoen: trajectories=readTrajectories(0.1), hvor 0,1 er tid i sekunder mellem to på hinanden følgende frames (tidsinterval, vist i panelet film Oplysninger, supplerende fig. 11B).
3. Udelukke baner svarende til forkert identificeret steder/baner. Give en liste over steder at udelukke. For eksempel, hvis du vil udelade steder 4, 5 og 28, skriv: baner = readTrajectories (0,1, [4, 5, 28]).
4. Beregne de øjeblikkelige diffusion koefficienter for hver enkelt af sporene af denne celle. I så fald beregner diffusion koefficient for en tidsforskydning = 4, kaldet D_1-4. For at gøre det, Kør i Matlab konsollen kommandoen: D = calculateDiffusion (baner, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha') hvor baner er baner opnåede i trin 3, 113.88e-3 er pixelstørrelse af de erhvervede billeder i mikron, 0.0015 er en øvre grænse for diffusion koefficienter af immobile partikler målt i µm²/s og 'alpha' er monteret modellen som forklaret nedenfor.
   Bemærk: Når du bruger et hurtigere kamera og behovet for flere rammer til at beregne parameteren diffusion øge det, fx til 20, ved D = calculateDiffusion (baner, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha', '', 20). Strengparameteren før 20, i eksemplet ovenfor, '', er det suffiks, der føjes til output-filer. Dette suffiks kan bruges til at adskille forskellige analyser.
5. Passe MSD med forskellige opgaver ved at kalde funktionen calculateDiffusion igen med en anden montering tilstand ('begrænset', 'gratis' eller 'instrueret'). I dette eksempel,» begrænset»: D = calculateDiffusion (baner, 113.88e-3, 0.0015, 'begrænset').
6. Opnå montering resultater for styret model, som vist i supplerende figur 20.
7. Nedbrydes baner i korte og lange baner. Bruge kommandoen: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) hvor 50 er den mindste længde i rammer af en bane anses længe (i det viste eksempel).
8. Studere korte baner ved hjælp af den samme montering i trin 4.3 beskrevne procedure: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'instrueret', 'Kort'). Analysere kort og anomale baner med kommandoen: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha', 'Kort').
9. Analysere lange baner for at klassificere typen bevægelse gennem deres øjeblik skalering spektrum (MSS)⁷. Kommandoen: trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, 'lange') viser analysen i skærmen og genererer en fil kaldet trajectoryClassification < suffiks > .txt den Directory results\TrackingPackage\tracks.

5. beregning af klyngen Ssize gennem partikel tæthed

Bemærk: Sørg for at alle scripts er gældende fra mappen, hvor videoen at blive analyseret (i eksemplet vist, VideoName/Serie1).

1. Analysere intensiteten af hver partikel langs deres bane. For at gøre det, påberåbe sig scriptet ved at skrive i konsollen Matlab: analyzeSpotIntensities, der tager som input baner beregnet ved U-banen i det første afsnit. I sin mest basale form, blot at kalde script uden et argument fra mappen, hvor videoen at blive analyseret (i eksemplet vist, VideoName/Series1) analyzeSpotIntensities(). Konfigurere dette grundlæggende problem på mange forskellige måder ved at give argumenter til scriptet som i: analyzeSpotIntensities («Arg1´, værdi1, ' Arg2´, værdi2,...). Gyldige argumenter med deres tilsvarende variable værdier (» ArgN´, ValueN) er angivet.
   1. («spotRadius´, 1)
      Analysere fluorescens intensitet ved hjælp af spotRadius af 1 pixel (som standard), der svarer til et plaster på størrelse 3 x 3 centreret på stedet ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      Bemærk: Vælg en spotRadius for et plaster på 5 x 5 centreret på stedet, af 2, osv.
   2. («onlyInitialTrajectories´, 1)
      Hvis dette argument er givet (sand, værdi i 1), analysere kun de baner, der starter i det første billede af video. Dette er nyttigt til at analysere kontrol billeder (som standard 0, falsk).
   3. («trackTrajectory´, 0)
      Hvis dette argument er angivet til 0 (falsk), derefter holde koordinat i stedet i dets første ramme for alle rammer (dette er nyttigt for immobile steder). Hvis argumentet angives til 1 (som standard 1, sand), er så stedet sporet langs video følgende koordinaterne beregnes ved U-banen.
   4. («excludeTrajectories´, [4,5,28])
      Omfatte bane antallet af disse baner, udelukkede i skridt 4.3 (i eksemplet med 4, 5, 28).
   5. («extendTrajectory ´, 1)
      Hvis dette argument er angivet til 1 (sand), derefter analysere intensitet i patch til slutningen af videoen (selvom bane stopper tidligere). Koordinaten i stedet er enten den sidste koordinat i bane (hvis trackTrajectory er sand) eller den første koordinat i bane (hvis trackTrajectory er falsk). Dette argument er falsk (0) som standard.
   6. («subtractBackground´, 1)
      Hvis denne parameter angives, derefter korrekt den rå fluorescens målt på hver plet af skøn over baggrunden fluorescens for at stedet (se nedenfor). Dette argument er sand (1), som standard.
   7. («meanLength´, stelnummer)
      Hvis denne parameter er indstillet, måles den gennemsnitlige intensitet spot udførligt angivet. Sæt 'meanLength', 20 til at måle den gennemsnitlige spot intensitet på de første 20 frames. Hvis argumentet ikke angives, er derefter spot intensiteten beregnet på hele bane (som standard, fuld længde).
   8. («showIntensityProfiles´, 1)
      Angiv denne parameter som 1 (som standard 0, falsk) afbilde intensitet profilen langs de forskellige rammer samt deres baggrund.
      Bemærk: Disse er meget nyttige til at identificere photobleaching, som vist i den supplerende figur 21. For hver sti analyserer rutine automatisk hvis det er muligt, at der har været photobleaching. Dette gøres ved at sammenligne intensitetsværdierne med Student's t i den første og sidste N ramme langs stien. N er som standard 10, men denne værdi kan ændres via argumentet ' Nbleach´.
   9. («backgroundMethod´, værdi)
      Sæt denne parameter for at bestemme baggrunden for hver plet. Dette kan gøres på flere måder, og som man bruge kan være valgte skiftende "værdi":
      1. («backgroundMethod´, 0)
         Brug denne værdi hen til manuelt identificere baggrunden for hele videoen. Giver mulighed for at vælge 8 punkter i det første billede af video. En plet omkring disse punkter er analyseret langs hele videoen, og 95% fraktil af alle disse intensiteter er valgt som baggrund intensiteten for alle steder.
      2. («backgroundMethod´, 1)
         Brug denne værdi hen til manuelt identificere baggrunden for hver ramme. Vælge 8 point for hver plet og hver frame. Det er en tidskrævende opgave, men det giver en masse kontrol til brugeren. 95% fraktil af støtteintensiteter i disse patches er valgt som baggrund intensiteten for dette sted i denne ramme.
      3. («backgroundMethod´, 2)
         Brug denne værdi skal beregnes på baggrund af hver plet anslået fra 8 punkter placeret i en cirkel omkring stedet med en radius, der styres af argumentet ' backgroundRadius´ (som standard, 4 * spotRadius).
      4. («backgroundMethod´, 3)
         Brug denne værdi til at beregne baggrunden for hver ramme ved først at placere cellen i videoen og derefter analysere intensiteten af cellen i hver ramme (supplerende figur 22).
         Bemærk: Baggrunden er valgt som den grå værdi på en given fraktil af denne fordeling (som standard 0,5 (= 50%), selv om denne parameter kan styres via argumentet ' backgroundPercentile´, denne værdi kan indstilles højere, for eksempel, 0,9 (= 90%) Hvis der ønsker de fleste af cellen skal betragtes som baggrund. For at hjælpe i identifikation af cellen, angiv hvilke er den maksimale baggrund værdi blev forventet langs rammer ved hjælp af argumentet ' maxBackground´ (for eksempel, i alle de analyserede videoer, baggrund værdi normalt aldrig går ud over 6000)¹³. Som standard er er denne indstilling angivet til 0, hvilket betyder, at denne hjælp ikke anvendes som standard. Se, som er cellen påvisning og området valgt til at anslå den baggrund ved at angive argumentet ' showImages´ til 1 (stop udførelsen til enhver tid ved at trykke på CTRL-C).
2. Indsamle diffusion og intensitet information til alle baner beregnet i trin 4 og 5.1, henholdsvis ved hjælp af gatherDiffusion.AndIntensity (). Samles kun diffusion og intensitet information til korte baner. For at gøre det, bruge suffikser anvendes i trin 4.7 og type: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) hvor ' Short´ er suffikset bruges i trin 4.7.
3. Samle øjeblik spektrum skalering og intensitet informationby skrive: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') hvor 'Lange' suffikset bruges i trin 4.7. En oversigt over alle de filer, der er genereret ved hjælp af denne protokol er vist i figur 2.

Representative Results

Brug af denne protokol tillader automatiseret sporing af partikler fundet i Fluorescens mikroskopi film og analyse af deres dynamiske egenskaber. I første omgang er celler transfekteret med fluorescently kombineret protein kan spores. Det passende niveau for receptorer præsenterer på celleoverfladen, der giver mulighed for sømløse rør fremstilles af cellen sortering (figur 1). Markerede celler er analyseret af JOHANNAS mikroskopi, der genererer videoer i et format, der kan studeres med de værktøjer, der beskrives i denne protokol (supplerende Video 1).

Videoerne genereret kan ikke analyseres direkte, og uafhængige rammer af hver video er påkrævet. Brugen af ImageJ genererer filer, der kan fortolkes ved hjælp af Matlab software som video frames i .tiff format eller masker. U-track spor partiklerne set i den valgte video og gemmer oplysningerne i Matlab (.mat) filer (movieData.mat, Channel_1_detection_result.mat, channel_1.mat, Channel_1_tracking_result.mat), se figur 2.

Som vist i figur 2, genererer beregning af diffusion koefficienter og klassificering af baner kommandoer, forskellige filer (diffusionCoefficients.txt, diffusionCoefficientsMobile.txt, diffusionCoefficientsShort.txt, trajectoryClassificationLong.txt, etc). Oplysningerne i disse filer styres bedst ved hjælp af Excel og prisme software. Oplysninger, der kan hentes fra denne analyse omfatter:

1. Andelen af immobile steder. Du kan bruge som reference af immobile partikler: 95% fraktil af D_1-4 opnåede værdier (1) (2) fra renset fluorescerende proteiner eller fra én partikler i faste celler knyttet til coverslips (figur 3A).
2. Procentdel af lange baner (> 50 frames) (figur 3B).
3. Form for bevægelse af de lange baner: rettet, gratis, begrænset (figur 3 c).
4. Diffusion koefficient (D_1-4) af mobile partikler i celler behandles med forskellige stimulus (figur 4A).

Trin 5 i protokol analyserer intensiteterne for hver partikel langs bane. Scriptet analyzeSpotIntensities vil udskrive på skærmen alle de oplysninger, der er analyseret. For hver plet og ramme, scriptet viser koordinaten for stedet i rammen (x, y) i pixelenheder, skøn over baggrunden fluorescens (k0), rå spot intensiteten i 3 x 3 patch, den korrigerede intensitet (beregnet som den rå intensitet minus dets baggrund), den maksimale værdi af intensitet observeret i patch og regionsnummer inden for masken, hvor dette sted er placeret på denne ramme. Et eksempel på slags output produceret er

spot = 43 ramme = 184
x = 78.0397
y = 72.5395
K0 = 1571
spotRawIntensity = 5550.1111
spotCorrectedIntensity = 3979.1111
maxCorrectedSpotIntensity = 6243
maskRegion = 2

Alle disse oplysninger gemmes i en logfil (results/TrackingPackage/tracks/log.txt) og en tabel, der kan læses fra Excel (results/TrackingPackage/tracks/spotIntensitiesByFrame.txt). Efter at have analyseret hver plet, udskriver scriptet den gennemsnitlige intensitet langs bane og regionen flertalsvalg i masken

spot = 43
meanCorrectedSpotIntensity langs frames = 4762.303
flertalsvalg region = 3

Disse oplysninger gemmes i logfilen over og en tabel, der kan læses fra et regneark (results/TrackingPackage/tracks/meanSpotIntensities.txt). Som et eksempel, betyder spot intensiteter (msi) for hver partikel langs deres bane i celler stimuleres med forskellige betingelser er vist i figur 4B. Vi kan nu bruge denne information til groft anslå størrelsen af de fluorescerende klynge. Som en plet betyder korrigeret intensitet er relateret med antallet af fluorescerende proteiner til stede i dette spot, og en monomer fluorescens kan måles gennem en lignende men uafhængigt eksperiment, direkte beregne antallet af receptorer pr partikel. Frekvens fordelingen af receptor antallet pr. partikel bruger som reference intensiteten af monomere protein udtrykt i de samme celler er vist i figur 4 c.

Saml diffusion og intensitet kommando oprettes to filer: én kaldet diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txtog et andet kaldet log_diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txt i mappen resultater / TrackingPackage/spor. Begge filer indeholder 1) spot indekset, 2) diffusion koefficienten, 3) intensiteten og 4) Regionsnummeret i masken. Disse filer kan læses fra et regneark.

På samme måde indsamle bane klassificering og intensitet kommando vil oprette to filer en kaldet trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt og et andet log_trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt i de Directory resultater/TrackingPackage/spor. Den første, der indeholder 1) spot indekset, 2) typen bevægelse, 3) stedet første øjeblik, 4) intensiteten, 5) D_1-4 og 6) Regionsnummeret inden for masken. Denne fil kan læses fra Excel.

En oversigt over alle de filer, der er genereret ved hjælp af denne protokol er vist i figur 2. Andre analyser, der kan udføres ved hjælp af denne protokol omfatter en sammenligning af de dynamiske parametre for små vs større steder, dvs monomerer vs oligomerer, variationer over disse dynamiske parametre induceret af ligander, hæmmere, membran sammensætning, ændring af signalering veje mv. En komplet analyse af CXCR4 adfærd som reaktion på dets ligand CXCL12 under forskellige forsøgsbetingelser er udført ved hjælp af denne protokol¹³.

Figur 1 : Celle sortering. Udtryk for normal god landbrugspraksis i Jurkat celler transfekteret med CXCR4-AcGFP før og efter celle sortering. Celle udtrykker lave niveauer af normal god landbrugspraksis (NGL^lav) er udvalgt og ansat til JOHANNAS eksperimenter.

Figur 2 : Oversigt over filer genereret. Figuren viser alle de filer, der er genereret ved hjælp af Matlab rutine beskrevet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Klassifikation af baner. Antallet af de forskellige typer af baner svarende til celler behandles med forskellige stimuli. (A) andelen af immobile steder, (B) procent af lange baner og (C) type bevægelighed i lange baner.

Figur 4 : Diffusion koefficient, gennemsnitlige spot Støtteintensiteter og antallet af receptorer pr partikel. (A) Distribution af korte diffusion koefficienter (D_1-4) værdier for hver plet i respons på forskellige stimuli, (I, II, II og IV). Rød linje repræsenterer middelværdien for D_1-4. (B) betyder spot intensiteter (msi) værdier for hver plet langs sin første 20 frames i respons på forskellige stimuli, (I, II, II og IV). Rød linje repræsenterer den gennemsnitlige intensitet værdi (SD). (C) procentdel af receptorer/partikel som uddraget fra intensitet fordeling af de enkelte partikler, idet bin bredde monomere protein intensitetsværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Åbning af en TIRFM fil i Fiji eller ImageJ. Indstillinger, der vises i vinduet Bio-formater ved at trække og slippe en .lif video. Venligst klik her for at downloade figuren. 

Supplerende figur 2: Vælg serie. Billeder til stede i .lif video. (A) vindue, der tillader udvælgelse af serien til at analysere, herunder multikanals billeder. (B) resultat eksempel på serien udvalg, herunder multikanalbillede (venstre) og tilsvarende video (til højre). Venligst klik her for at downloade figuren. 

Supplerende figur 3: Opdele kanaler. (A) vindue fange af kommandoerne ImageJ behov til at opdele kanaler på et multikanalbillede og (B) resultat eksempel på kanalen split. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 4: Sammenflet kanaler. (A) samle forskellige kanaler i et enkelt billede. (B) kanalvalg for en sammenlægning. (C) resultat eksempel på kanal fletningen. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 5: Synkronisere windows. (A) lokalisering i menuen ImageJ af de kommandoer, der for billede synkronisering og (B) resulterende vindue. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 6: Vælg området af interesse. (A) udvælgelse af interesse ved hjælp af den rektangulære markeringsværktøj, og (B) resultatet af image crop-vinduet. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 7: Gemme video. Gemme region af interesse som en billedsekvens og parametre for Gem som billede sekvensen vindue. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 8: Segmentering. (A) åben segmentering editor plugin i den ImageJ plugins menu. (B) tilføje etiketter/materialer til segmenteringen. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 9: Maske design. (A) udvælgelsen af egnede etiketter og definition af den grønne maske. (B) udvælgelse af den røde maske. Eksempel på to masker svarende til to etiketter. (C) gemme masker som en .tiff. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 10: MATLAB arbejdsmappe. Valg af den korrekte mappe, der indeholder serien der skal analyseres. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende Figur 11: U-track hovedmenuen. (A) film udvalg, (B) movie oplag og (C) kanal indstillingsmenuer. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 12: Vælg typen objekt til at spore. Vælg tracking af én partikler. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende Figur 13: Påvisning af partikler. (A) U-bane, Kontrolpanel. (B) eksempel på indstillinger til påvisning af partikler. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende Figur 14: Eksempel på resultaterne for partikel påvisning. Forskellige vinduer, der inkluderer en fremviserens menu, movie indstillingsmenuen og filmen. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende Figur 15: Sporing menu. Eksempel på indstillinger. Sporing af (A), (B) indstilling af-ramme til ramme forbinder og (C) hul lukker, flette og opdele menuer. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende Figur 16: Eksempel på resultaterne for partikel sporing. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 17: Track analyse menu. Eksempel på indstillinger. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 18: Kontrol af spor analyse. Skærmen vises efter spor analyse, herunder en video-vinduet viser de partikler opdaget og deres tilsvarende spor. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 19: Beregning af diffusion koefficienter. Histogrammer af diffusion koefficienterne beregnes (venstre) og betyde squared deplacement (MSD, højre). Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 20: Beregning af diffusion koefficienter herunder forskellige montering modes. Histogrammer af diffusion koefficienterne beregnes (venstre) og betyde squared deplacement (MSD, højre) til den lukkede model. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 21: Intensitet profiler. Eksempel på spot intensitet langs dens bane (blå linje) og baggrund (rød linje). Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 22: Baggrunden for hver ramme. Venstre: Celle eksempelbillede. Midten: Automatisk opdaget celle. Højre: Område vælges automatisk som baggrund. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende Video 1: Eksempel på en typisk JOHANNAS video mikroskopi viser tilstedeværelsen af partikler med forskellige intensiteter og typer af bevægelser. Venligst klik her for at downloade videoen.

Supplerende materiale 1: Filer, der indeholder alle de protokol scripts ansat i de ad hoc- rutiner ansat for klassificering af baner og analyse af klyngestørrelsen. Venligst klik her for at downloade materialerne.

Discussion

Den beskrevne metode er let at udføre selv uden at have nogen tidligere erfaring med Matlab. Matlab rutiner kræver imidlertid meget nøjagtighed med nomenklaturen for de forskellige kommandoer og lokalisering af de forskellige mapper ansat af programmet. I sporing analyse rutine (trin 3), flere parametre kan ændres. Vinduet "Indstilling Gaussisk-blanding Model Fitting" (trin 3.8) styrer, hvordan U-bane vil opdage én partikler på video. Dette gøres ved at montere en Gaussisk blanding model som beskrevet i³. En af de vigtigste parametre for denne montering definerer et filter for at hjælpe med at identificere lokale maxima. Succes af denne funktion afhænger af billedets kontrast og støj i billederne. Den første parameter (Alpha værdi ved sammenligning med lokale baggrund) styrer tilliden af en maxima er en reel sted, mens de anden hjælper til at reducere støj under identifikation af steder. Vigtige parametre i trinnet "Tracking" (3,9) er antallet af frames at lukke huller (der er et spor kan spænde over rammer, hvor partiklen ikke er faktisk set, men det er set før disse rammer og efter disse rammer; i eksemplet, 0) , og antallet af rammer, som et spor skal spænde over for at blive betragtet som en vellykket track (i vores eksempel, 20; denne parameter er relateret til kamera erhvervelse hastighed og antal rammer i sporet skal være således, at det giver mulighed for beregning af diffusion co effektiv). Det er også vigtigt at beslutte, om du vil flette og opdele segmenter (i eksemplet med disse to muligheder blev valgt). Derefter skal parametrene for trin 1 i omkostninger funktioner (ramme til ramme forbinder) angives. Denne funktion styrer, hvordan partikler er sporet langs rammerne. De vigtigste parametre på dette punkt er Udvalget af Brownske Søg radius, som styrer, hvor langt hver plet forventes at blive i den næste ramme. I vores eksempel valgt vi 0 og 5 som nedre og øvre grænser, henholdsvis. Bemærk at disse parametre er meget specifikke karakter af de partikler, der spores, og at de kan have til at blive tunet i hvert enkelt tilfælde. Særlig vigtig er den skalering magt i Brownske og lineær Søg radier. Disse skalering beføjelser afhænger af form for bevægelse af partikler (gratis eller begrænset diffusion). I eksemplet med blev værdier (0,5, 0,01) valgt til fri diffusion. For den specifikke dokumentation for disse parametre, se³.

I beregningen af diffusion koefficienter befale (skridt 4.4), kan den øvre grænse for den diffusion immobile partikler være kendt fra tidligere eksperimenter eller ved at køre funktionen calculateDiffusion på et særskilt projekt med immobile partikler (renset monomere fluorescerende proteiner) og ser diffusion koefficienterne rapporteret. Denne funktion kræver to ekstra parametre: ' outputSuffix´, som er føjet til output filnavne og som standard tager den tomme værdi, og ' plotLength´, der som standard er 13 og antallet af tidsforskydning (sekunder) i som diffusion beregningen udføres. Montering mode 'alpha' indebærer en tilpasning af MSD til kurven

det vil sige halter en offset (MSD₀) og en power funktion af tiden. Eksponent for denne magt funktion, , bestemmer, om bevægelsen er begrænset (0 < α < 0,6), unormal (0,6 < α < 0,9), gratis (0,9 < α < 1.1), eller instrueret (α > 1.1). For en gennemgang af denne form for analyse henvises læseren til Manzo et al.⁹

Beregningen af diffusion koefficienter⁴ producerer to output tal (Se supplerende figur 19). Den ene viser et histogram over de diffusion koefficienter beregnede (Bemærk, at på dette tidspunkt, der er en uafhængig diffusion koefficient for hver bane). Middelværdi og 95% fraktil for disse koefficienter er vist i konsollen Matlab. Anden afbildning viser MSD (rød kurve) og antallet af trin anses for at beregne det som en funktion af tidsforskydning for disse baner, anses for at være mobile (dem hvis diffusion koefficient ligger over den tærskel, der er angivet i kommandolinjen). Gennemsnit og standardafvigelse for de mobile baner er beregnet (disse er værdierne for baner i en enkelt celle). I eksemplet med er eksponenten 0,59 betyder at bevægelsen er begrænset. For denne kurve montering rapporter at programmet usikkerheden til hver enkelt af de parametre, der (vist som standardafvigelsen af hver enkelt) og godhed af fit (en perfekt pasform ville nå nul). På dette tidspunkt og efter at have kontrolleret værdien af alpha kan vi beslutte at passe MSD med forskellige opgaver:

    Hvis 0 < α < 0,6 (begrænset)

Hvis 0,9 < α < 1.1 (gratis)

Hvis α > 1.1 (rettet)

Unormal baner kan monteres med forskellige opgaver. I tilfælde af begrænset partikler kan du beregne indespærring størrelse (i mikron) som i Destainville et al.¹⁴

En god indikator for en korrekt montering er at godhed af pasformen skal falde fra alpha montering til den endelige montering (i eksemplet med godhed passer falder fra 0.30474 til 0.15749, supplerende figur 19-20). calculateDiffusioncreates to filer i "results\TrackingPackage\tracks" inde i mappen serie kaldet "diffusionCoefficients.txt" og "diffusionCoefficientsMobile.txt". Disse filer indeholder tre kolonner: 1) indekset for hver indgang bane, 2) deres tilsvarende diffusion koefficient, 3) flertalsvalg regionen i den maske, hvor dette track tilhører (regionerne er fremstillet af filen "mask.tif", som vi oprettede i trin 2.7; Hvis denne fil ikke findes, så findes denne kolonne ikke). Du kan bruge denne fil og de analoge filer genereret for andre celler til at analysere fordelingen af diffusion koefficient for et sæt celler under lignende forsøgsbetingelser.

I beregningen af diffusion koefficient for korte baner (trin 4,7-4.8), er den sidste parameter 'Kort' en endelse tilføjes til output filnavn, så du kan analysere forskellige delgrupper af baner uden at overskrive diffusionCoefficients.txt filer. Selve navnet på output-filer er "diffusionCoefficients < suffiks > .txt" og "diffusionCoefficientsMobile < suffiks > .txt". Hvis ingen suffiks er givet, som i den generelle analyse udført ovenfor, antages en tom suffiks. Model parametre (D, v og MSD₀) kan afvige fra de monteret på alle baner. Mest bemærkelsesværdigt standardafvigelsen af parametre samt godhed fit normalt øge. Årsagen er, at korte baner er mere ustabilt og en pålidelig montering er vanskeligere.

Analyse af lange baner (trin 4.9) klassificere dem i begrænset (1), gratis (2) eller styret (3) efter deres første øjeblik og dens placering i forhold til 2,5 og 97,5% percentiler i første øjeblik af 500 tilfældige stier med Brownske bevægelser, det samme Diffusion koefficient og længde som bane bliver analyseret og simuleret af Monte Carlo. Hvis det første øjeblik af stien ved at blive analyseret er under 2,5% af de første øjeblikke observeret i simuleringer, er stien ved at blive undersøgt klassificeret som begrænset. Hvis det er over 97,5% af de simulerede første øjeblikke, klassificeres som anvist; ellers, stien er klassificeret som Brownske. I kommandoen ansat, 113.88e-3 er pixelstørrelse i µm, 0.0015 er den øvre grænse for den diffusion immobile steder målt i µm2/s, og 'Lang' er suffikset for output filnavn. Den første kolonne i denne fil ("trajectoryClassificationLong.txt") er den bane nummer, andet er dens klassificering (1 = begrænset, 2 = gratis, 3 = instrueret), og tredje er bane første øjeblik.

Script til at beregne intensiteten af hver partikel (trin 5.1) er meget fleksible og tillader sporing fluorescens-intensiteten på mange forskellige måder (hver især velegnet til forskellige situationer som tracking immobile steder af et kontrol-eksperiment eller sporing meget bevægelige steder over en celle med variabel fluorescerende baggrund). Scriptet vil analysere alle baner langs alle rammer. For hver plet på hver ramme det vil måle intensiteten af pixels omkring stedet (det analyserer en firkantet plet omkring stedet, som standard af en størrelse 3 x 3 pixels), anslår stedet baggrund og beregne fluorescens forskellen mellem stedet og de baggrund. Procentdelen af photobleaching partikler og antallet af fluorescerende partikler i en enkelt klynge, set som en enkelt plet, kan skønnes på denne måde.

Denne automatiske metode (gatherTrajectoryClassificationAndIntensity) giver oplysninger på flere parametre (spot intensitet, lateral diffusion, type af motion), der kan bidrage til at studere forholdet mellem spot størrelse og dens dynamik på basal betingelser, og hvordan forskellige behandlinger kan redigere disse parametre.

Den største begrænsning af metoden er, at det kræver celle Transfektion med fluorescerende protein kan spores. Transfektion fører som regel til protein overekspression, en kendsgerning, som hindrer enkelt protein sporing. En celle sortering skridt skal medtages markere celler udtrykker en række receptorer, der giver mulighed for registrering og sporing af én partikler ved SPT-JOHANNAS mikroskopi. Denne metode kan også være ansat til sporing af biomolekyler mærket med quantum dots eller Fab fragmenter. Den beskrevne protokol kræver en række kontrolelementer, der skal analyseres tidligere for at sikre, at konklusionerne fra drevet fra analysen er korrekte. Først og fremmest er det kritisk at fastsætte passende udtryk betingelserne, der giver mulighed for registrering og sporing af én partikler. Film med tætheder på ~ 4,5 partikler/µm², svarende til 8.500-22.000 receptorer/celle, blev brugt til at analysere den spatio-temporale organisation af cellens membran receptor¹³.

Det er vigtigt at fastlægge den mindste påviselige diffusion koefficient ved hjælp af renset monomere AcGFP proteiner eller faste celler. I begge tilfælde forudsættes det, at der er ingen diffusion og derfor vi anslår diffusion værdier af partikler analyseres i disse betingelser svarer til immobiliseret partikler og bruges til at skelne mellem mobile og immobile baner¹³.

Den analyse, vi har præsenteret her er en generel bane analyseværktøj, der kan anvendes til analyse af diffusion af receptorer af superresolution, analyse af diffraktion begrænset billeder og analyse af cellulær bevægelse af standard mikroskopi . Den største fordel ved denne metode med andre tidligere beskrevet, såsom analyse af antallet og lysstyrke¹¹, er at det giver mulighed for evaluering af de gennemsnitlige intensitetsværdier for hver enkelt spot langs dens bane, under hensyntagen til tidspunktet for overlevelse af AcGFP monomere protein før photobleaching. Overlevelsestid af et molekyle før photobleaching afhænger stærkt af excitation betingelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Jurkat cells	ATCC	CRL-10915	Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP	Clontech	632469	Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator	BioRad		We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands.
Cytomics FC 500 flow cytometer	Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter	Beckman Coulter		Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit	DakoCytomation	K0078	Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes	MatTek corporation	P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Recombinant human CXCL12	PeproTech	300928A
Inverted Leica AM TIRF	Leica
EM-CCD camera	Andor	DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software	Danuser Laboratory
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi	FiJI		https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software			Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism	GraphPad software