Processamento de imagem protocolo para análise de difusão e o tamanho do Cluster de receptores de membrana por microscopia de fluorescência
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para acompanhamento de análise de imagem que permite a avaliação quantitativa dos coeficientes de difusão, tipos de tamanhos de cluster e o movimento de partículas único detectados por microscopia de fluorescência de partícula única.
Abstract
Acompanhamento em uma sequência de vídeo e a análise posterior de suas trajetórias de partículas hoje em dia é uma operação comum em muitos estudos biológicos. Usando a análise dos receptores de membrana celular de clusters como modelo, apresentamos um protocolo detalhado para esta tarefa de análise de imagem usando Fiji (ImageJ) e rotinas de Matlab para: 1), definir as regiões de interesse e projetar máscaras adaptadas a estas regiões; 2) acompanhar as partículas em vídeos de microscopia de fluorescência; 3) analise as características de difusão e intensidade de faixas selecionadas. A análise quantitativa dos coeficientes de difusão, tipos de movimento e o tamanho do cluster obtidas por microscopia de fluorescência e processamento de imagem fornece uma ferramenta valiosa para determinar objetivamente a dinâmica da partícula e as consequências de modificar condições ambientais. Neste artigo apresentamos protocolos detalhados para a análise desses recursos. O método descrito aqui não só permite a detecção de rastreamento único-molécula, mas também automatiza a estimativa dos parâmetros de difusão lateral na membrana celular, classifica o tipo de trajetória e permite a análise completa, assim, superar a dificuldades em quantificar o tamanho de ponto ao longo de sua trajetória inteira na membrana celular.
Introduction
Proteínas de membrana incorporadas a bicamada lipídica estão em contínuo movimento devido à difusão térmica. Sua dinâmica é essencial para regular as respostas celulares, como interações intermoleculares permitem a formação de complexos que variam em tamanho de monômeros de oligômeros e influenciam a estabilidade de complexos de sinalização. Elucidar os mecanismos para controlar a dinâmica da proteína é, portanto, um novo desafio em biologia celular, necessária para compreender as vias de transdução de sinal e para identificar as funções da célula imprevistos.
Foram desenvolvidos alguns métodos ópticos para estudar essas interações na vida, as células1. Entre estes, microscopia de fluorescência (TIRF) de reflexão interna total, desenvolvida na década de 1980, permite o estudo de interações moleculares ou muito próximo da membrana celular2. Para estudar parâmetros dinâmicos de trajetórias de proteína de membrana obtidos de dados TIRF em células vivas, uma única partícula rastreamento método (SPT) é necessária. Embora vários algoritmos estão disponíveis para isto, atualmente usamos aqueles publicados por Jaqaman et al.3 que abordam a heterogeneidade de movimento das partículas em um campo de partículas densas, vinculando as partículas entre quadros consecutivos para se conectar a faixa resultante segmentos em trajetórias completas (desaparecimento temporário das partículas). O software capta a partícula mesclando e dividindo esse resultado de agregação e dissociação de eventos3. Um dos dados de saída deste software é a detecção das partículas ao longo da trajetória inteira definindo suas posições X e Y em cada quadro.
Uma vez que as partículas são detectadas, aplicamos diferentes algoritmos para determinar o curto lapso difusão coeficiente (D1-4)4,5. Aplicando-se o espectro de dimensionamento do momento (MSS)6,7,8 análise ou por encaixe o valor ‘alpha’ pelo ajuste de deslocamento o quadrado médio (MSD) para a curva9, podemos também classificar as partículas de acordo com o tipo de trajetória.
Análise de intensidade local em imagens de fluorescência é um objectivo comum para os cientistas no campo10,11. O algoritmo mais comum usado é o número de chamados e brilho. Este método, no entanto, não permitir a detecção de intensidade correta do frame-por-frame em partículas na fração móvel. Temos, assim, geramos um novo algoritmo para avaliar estas partículas intensidades quadro-a-quadro e determinar o seu estado de agregação. Uma vez que as coordenadas de cada partícula são detectadas usando U-Track2 software3, definimos a sua intensidade em cada quadro sobre a trajetória completa, tendo também em conta o plano de fundo de célula em cada quadro. Este software oferece diferentes possibilidades para determinar a intensidade do ponto e o plano de fundo da célula e, usando proteínas monoméricas e dimérica conhecidas como referências, calcula o número aproximado de proteínas na partícula detectada (tamanho do cluster).
Neste artigo, descrevemos um cuidado guia para executar estas três etapas: 1) detecção e rastreamento única partículas ao longo de um vídeo de microscopia de fluorescência usando U-faixa; 2) analisando o coeficiente de difusão instantânea (D1-4) de tais partículas e o tipo de movimento (confinado, livre ou dirigido) de partículas com longa trajetória por MSS; 3) medindo a intensidade local ao longo do vídeo corrigido por fluorescência fundo estimado para cada ponto. Isso permite que a estimativa de tamanho de cluster e identificação das etapas fotobranqueamento.
O uso do presente protocolo não requer habilidades especializadas e pode ser executado em qualquer laboratório com cultura celular, instalações de microscopia e citometria de fluxo. O protocolo usa ImageJ ou Fiji (uma distribuição do ImageJ12), U-faixa3e algumas rotinas de hoc feita anúncio (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-track e ad-hoc rotinas atropelar Matlab que pode ser instalado em qualquer computador compatível.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito é fácil de executar mesmo sem ter qualquer experiência anterior com Matlab. No entanto, rotinas Matlab extremamente exigem precisão com a nomenclatura dos diferentes comandos e a localização das diferentes pastas utilizadas pelo programa. No acompanhamento de rotina de análise (etapa 3), vários parâmetros podem ser modificados. A janela “Configuração Gaussian-mistura modelo encaixe” (passo 3.8) controla como U-faixa irá detectar partículas única no vídeo. Isso é feito colocando-se um mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nós somos gratos a Carlo Manzo e Maria García Parajo para sua ajuda e código-fonte da análise do coeficiente de difusão. Este trabalho foi financiado em parte por subvenções do Ministério espanhol de ciência, inovação e universidades (SAF 2017-82940-R) e o programa de RETICS do Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 e RD16/0012/0006; CARRIER). LMM e JV são suportados pelo programa COMFUTURO do CSIC a Fundación General.
Materials
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
References
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