PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

Maria  G. Garone; Valeria de Turris; Alessandro Soloperto; Carlo Brighi; Riccardo De Santis; Francesca Pagani; Silvia Di Angelantonio; Alessandro Rosa

doi:10.3791/59321

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방법 논문

PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

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DOI:

10.3791/59321

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2019년 5월 1일

Maria G. Garone¹ , Valeria de Turris² , Alessandro Soloperto² , Carlo Brighi² , Riccardo De Santis³ , Francesca Pagani²^,⁴ , Silvia Di Angelantonio²^,⁴ , Alessandro Rosa¹^,²

¹Department of Biology and Biotechnology Charles Darwin, Sapienza University of Rome, Italy, ²Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, Italy, ³Laboratory of Stem Cell biology and Molecular Embryology, The Rockefeller University, USA, ⁴Department of Physiology and Pharmacology, Sapienza University of Rome, Italy

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포를 유도성 piggyBac 벡터에서 전사 인자의 발현에 의해 척추 또는 두개골 정체성을 가진 모터 뉴런으로 신속 하 고 효율적으로 전환 할 수 있습니다.

초록

우리는 여기에서 인간 유도 만능 줄기 세포 로부터 기능적 척추 및 두개골 운동 뉴런을 얻는 방법을 설명 한다 (iPSCs). 운동 뉴런으로의 직접 전환은 전사 인자의 대체 모듈, 즉 Ngn2, Isl1 및 Lhx3 (NIL) 또는 Ngn2, Isl1 및 Phox2a (닙)의 자 궁 외 발현에 의해 얻어진 다. NIL과 닙은 각각 척추와 두개골 운동 신경 정체성을 지정 합니다. 우리의 프로토콜은 NIL 또는 닙이 piggyBac 전치 벡터를 통해 게놈에 안정적으로 통합 되는 수정 된 iPSC 라인의 생성으로 시작 합니다. 트랜스 유전자의 발현은 이어서 독 시 사이 클린에 의해 유도 되 고, 5 일 후에, iPSCs를 MN 조상로 전환 한다. 이후 성숙, 7 일 동안, 척추 또는 두개골 MNs의 동종 인구에 이르게. 우리의 방법은 이전 프로토콜에 비해 몇 가지 장점을 보유: 그것은 매우 신속 하 고 단순화; 그것은 바이러스 감염이 나 추가 MN 격리를 필요로 하지 않습니다; 그것은 활동 전위의 기차를 발사 하는 능력에 의해 입증 된 대로, 성숙의 놀라운 학위와 다른 MN 하위 인구 (척추와 두개골)를 생성 할 수 있습니다. 더욱이, 다 수의 모터 뉴런은 혼합 된 집단 으로부터 정제 없이 얻어질 수 있다. iPSC 유래 척추 및 두개골 모터 뉴런은 운동 신경의 근 위축 성 측 삭 경화 증 및 기타 신경 변성 질환의 시험관 내 모델링에 사용 될 수 있다. 균질 한 운동 뉴런 집단은 세포 형 특정 약물 스크리닝을 위한 중요 한 자원을 나타낼 수 있다.

서론

운동 뉴런 (MN) 변성은 근 위축 성 측 삭 경화 증 (ALS)과 척추 근육 위축 (SMA)과 같은 인간의 질병에서 원인 역할을 한다. 인간 MN의 복잡성을 탈환 하는 적절 한 시험관 내 셀 모델 시스템을 확립 하는 것은 새로운 치료 접근법의 개발을 향한 중요 한 단계 이다. 유도 만능 줄기 세포 (ipscs)는 주목할 만한 복수형 다이 신 분화 특성을 부여 받고 있으며, 이제는 운동 신경 질환¹^,²에 의해 영향을 받는 많은 환자 로부터 유래 되었다. MN 질환에 관련 된 병원 성 돌연변이를 운반 하는 추가 iPSC 라인은 제어 "건강 한" 만능 줄기 세포 로부터 시작 하 여 유전자 편집에 의해 생성 되었다³. 이들 라인은 MNs로의 iPSC 분화를 위한 적절 한 방법이 제공 되는 경우 시험관 내 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 유용한 도구를 나타낸다. 이 방법의 개발 뒤에 이론적 근거는 성숙한 기능적인 MNs를 초래 하는 빠르고 능률적인 분화 프로토콜을 가진 MN 질병에 관심 있는 과학적인 공동체를 제공 하기 위한 것입니다. 이 방법의 첫 번째 이점은 실행 시간입니다. 또 다른 강도의 포인트는 정제 단계의 제거에서 온다. 마지막으로, 프로토콜....