Conversie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in functionele spinale en craniale motor neuronen met behulp van PiggyBac vectoren
Summary
Dit protocol maakt een snelle en efficiënte omzetting van geïnduceerde pluripotente stamcellen in motorische neuronen met een wervelkolom of schedel identiteit, door buitenbaarmoederlijke expressie van transcriptiefactoren van afleidbaar piggyBac vectoren.
Abstract
We beschrijven hier een methode om functionele spinale en craniale motor neuronen te verkrijgen van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). Directe omzetting in motor neuron wordt verkregen door een buitenbaarmoederlijke expressie van alternatieve modules van transcriptiefactoren, namelijk Ngn2, Isl1 en Lhx3 (NIL) of Ngn2, Isl1 en Phox2a (NIP). NIHIL en NIP specificeren, respectievelijk, spinale en craniale motor neuron identiteit. Ons protocol begint met de generatie van gemodificeerde iPSC lijnen waarin nihil of NIP stabiel zijn geïntegreerd in het genoom via een piggyBac transposon vector. Expressie van de transgenen wordt vervolgens geïnduceerd door doxycycline en leidt, in 5 dagen, tot de omzetting van iPSCs in MN progenitoren. Latere rijping, voor 7 dagen, leidt tot homogene populaties van spinale of craniale MNs. Onze methode heeft verschillende voordelen ten opzichte van eerdere protocollen: het is zeer snel en vereenvoudigd; het vereist geen virale infectie of verdere MN isolatie; het maakt het genereren van verschillende MN sub-populaties (spinale en craniale) met een opmerkelijke mate van rijping, zoals blijkt uit de mogelijkheid om treinen van actiepotentialen brand. Bovendien kan een groot aantal motor neuronen worden verkregen zonder zuivering van gemengde populaties. iPSC-afgeleide spinale en craniale motor neuronen kunnen worden gebruikt voor in vitro modellering van Amyotrofische laterale sclerose en andere neurodegeneratieve ziekten van de motor neuron. Homogene motor neuron populaties kunnen vertegenwoordigen een belangrijke bron voor cel type specifieke drug screenings.
Introduction
Motor neuron (MN) degeneratie speelt een oorzakelijke rol bij menselijke ziekten, zoals amyotrofische lateraal sclerose (ALS) en spinale spieratrofie (SMA). Het opzetten van geschikte in vitro Cell modelsystemen die de complexiteit van de menselijke MN recapituleren is een belangrijke stap in de richting van de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), die zijn begiftigd met opmerkelijke plurilineage differentiatie eigenschappen, zijn nu afgeleid van een aantal patiënten die getroffen zijn door motor neuron ziekten1,2. Extra iPSC lijnen die pathogene mutaties in verband met MN ziekten zijn gegenereerd door het bewerken van genen, te beginnen van de controle “gezonde” pluripotente stamcellen3. Deze lijnen vertegenwoordigen nuttige hulpmiddelen voor in vitro Disease modellering en drug screening, op voorwaarde dat passende methoden voor iPSC differentiatie in MNs beschikbaar zijn. De grondgedachte achter de ontwikkeling van deze methode is om de wetenschappelijke gemeenschap geïnteresseerd in MN ziekten met een snelle en efficiënte differentiatie protocol die aanleiding geven tot volwassen functionele MNs te bieden. Het eerste voordeel van deze methode is het tijdsbestek van de uitvoering. Een ander relevant punt van sterkte komt uit de afschaffing van om het even welke reinigingsstap. Ten slotte kan het protocol worden gebruikt om twee verschillende populaties van motorische neuronen te genereren.
De mogelijkheid van het genereren van verschillende subtypen van MNs is bijzonder relevant voor het modelleren van MN ziekten. Niet alle MN subtypen zijn even kwetsbaar in ALS en SMA en het begin van de symptomen in verschillende motor units sterk van invloed op de prognose. In ALS, spinale begin met symptomen die beginnen in de bovenste en onderste ledematen leidt tot de dood in ongeveer 3-5 jaar4. Omgekeerd, bulbaire begin, te beginnen met degeneratie van craniale MNs, heeft een slechtste prognose. Bovendien is het percentage van bulbaire begin significant hoger bij patiënten met mutaties in de RNA-bindende eiwitten FUS en TDP-43 dan bij personen met SOD1 mutaties5. Bijna de totaliteit van alternatieve MN differentiatie protocollen is gebaseerd op de activiteit van retinoic zuur (RA), die een spinale karakter verleent aan differentiëren iPSCs6,7,8. Dit beperkt de mogelijkheid van het bestuderen van intrinsieke factoren, die kunnen worden beschermend in specifieke MN subtypen9,10.
In overeenstemming met een eerdere werk in de muis embryonale stamcellen11, hebben we onlangs aangetoond dat in de menselijke iPSCs buitenbaarmoederlijke expressie van Ngn2, Isl1 en LHX3 (Nil) induceert een spinale MN identiteit, terwijl Ngn2 en Isl1 plus PHOX2A (NIP) specificeren craniale MNs12. We hebben dus ontwikkelde een efficiënt protocol, wat leidt tot de productie van menselijke MNs begiftigd met functionele eigenschappen in een 12 dagen turnaround. Het doel van deze methode is om, in een korte tijd en zonder de noodzaak voor de reiniging (bijv. door FACS), cel populaties zeer verrijkt voor MNs met spinale of craniale identiteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol maakt het mogelijk om efficiënt te converteren menselijke iPSCs in spinale en craniale motor neuronen dankzij de buitenbaarmoederlijke expressie van Lineage-specifieke transcriptiefactoren. Deze transgenen worden afleidbaar door doxycycline en stabiel geïntegreerd in het genoom dankzij een piggyBac op transposon gebaseerde vector. In een gemengde populatie, zal een of meerdere exemplaren van de piggyBac vector willekeurig worden geïntegreerd in het genoom van de individuele cellen, het verhogen van het ri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de Imaging Facility te bedanken bij Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di tecnologia, voor ondersteuning en technisch advies. Wij zijn dankbaar voor de leden van het centrum voor het leven nano wetenschap voor nuttige discussie. Dit werk werd gedeeltelijk gesteund door een toelage van AriSLA (proef toelage 2016 “StressFUS”) aan AR.
Materials
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | chemicals for electrophysiological solutions |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Cell dissociation reagent |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003 |
| anti-goat Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848 |
| anti-mouse Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130 |
| anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117 |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Immunological Sciences | IS-20152-1 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Serum free supplement for neuronal cell maintenance |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Brain-Derived Neurotrophic Factor |
| Blasticidin | Sigma-Aldrich | 203350 | Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Clampex 10 software | Molecular Devices | Clampex 10 | Membrane currents recording system |
| Corning Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports |
| CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA | Biological Industries | 05-710-1E | Freezing medium for human iPSCs |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5146 | chemicals for electrophysiological solutions |
| DAPI powder | Roche | 10236276001 | 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Gamma secretase inhibitor |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Basal medium for cell culture |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Commercial human iPSC line |
| E.Z.N.A Total RNA Kit | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Glial-Derived Neurotrophic Factor |
| Gibco Episomal hiPSC Line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Commercial human iPSC line |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health. |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | chemicals for electrophysiological solutions |
| iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | Kit for gene expression analysis using real-time qPCR |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument |
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | chemicals for electrophysiological solutions |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | chemicals for electrophysiological solutions |
| L-ascorbic acid | LKT Laboratories | A7210 | Used in cell culture as an antioxidant |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | iX83 FluoView1200 | Confocal microscope for acquisition of immunostaining images |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | chemicals for electrophysiological solutions |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Mounting Medium | Ibidi | 50001 | Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays |
| Multiclamp patch-clamp amplifier | Molecular Devices | 700B | Membrane currents recording system |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability. |
| Neon 100 μL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Cell electroporation kit |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Cell electroporation system |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer |
| NutriStem-XF/FF | Biological Industries | 05-100-1A | Human iPSC culture medium |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | Used for cell fixation in immunostaining assays |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium |
| PBS Ca2+/Mg2+ free | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria. |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays |
| Upright microscope | Olympus | BX51VI | Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival |
| μ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Support for high–end microscopic analysis of fixed cells |
References
- Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
- Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
- Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
- Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
- Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
- Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
- Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
- Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960 (2016).
- Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
- De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
- Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
- Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
- Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
- Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
- Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
- Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).
