Conversion de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs) en neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels utilisant des vecteurs PiggyBac
Summary
Ce protocole permet une conversion rapide et efficace des cellules souches pluripotentes induites en neurones moteurs avec une identité spinale ou crânienne, par l’expression ectopique des facteurs de transcription des vecteurs inductibles de piggyBac.
Abstract
Nous décrivons ici une méthode pour obtenir des neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs). La conversion directe en neurone moteur est obtenue par l’expression ectopique de modules alternatifs de facteurs de transcription, à savoir Ngn2, Isl1 et Lhx3 (NIL) ou Ngn2, Isl1 et Phox2a (NIP). NIL et NIP spécifient, respectivement, l’identité du neurone du moteur rachidien et crânien. Notre protocole commence par la génération de lignes iPSC modifiées dans lesquelles NIL ou NIP sont intégrés de manière stable dans le génome via un vecteur de transposon piggyBac. L’expression des transgènes est ensuite induite par la doxycycline et conduit, en 5 jours, à la conversion des IPSC en progéniteurs mn. La maturation subséquente, pendant 7 jours, conduit à des populations homogènes de MNs spinales ou crânienne. Notre méthode contient plusieurs avantages par rapport aux protocoles précédents: il est extrêmement rapide et simplifié; il ne nécessite pas d’infection virale ou d’isolement MN supplémentaire; Il permet de générer différentes sous-populations de MN (spinale et crânienne) avec un degré remarquable de maturation, comme en témoigne la capacité de tirer des trains de potentiels d’action. En outre, un grand nombre de neurones moteurs peuvent être obtenus sans purification de populations mixtes. les neurones moteurs spinaux et crânien dérivés de l’iPSC peuvent être utilisés pour la modélisation in vitro de la sclérose latérale amyotrophique et d’autres maladies neurodégénératives du Neuron du moteur. Les populations homogènes de neurons moteurs peuvent représenter une ressource importante pour les dépistages de médicaments spécifiques au type cellulaire.
Introduction
La dégénérescence du neurone du moteur (MN) joue un rôle causal dans les maladies humaines telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et l’atrophie musculaire spinale (SMA). L’établissement de systèmes de modèles cellulaires in vitro adaptés qui récapitulent la complexité du MN humain est une étape importante vers le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Les cellules souches pluripotentes induites (ipscs), qui sont dotées de propriétés de différenciation plurilinéale remarquables, ont maintenant été dérivées d’un certain nombre de patients touchés par les maladies du neurone moteur1,2. D’autres lignées iPSC porteuses de mutations pathogènes associées à des maladies du MN ont été générées par l’édition génique, à partir de cellules souches pluripotentes de contrôle «saines»3. Ces lignes représentent des outils utiles pour la modélisation des maladies in vitro et le dépistage des médicaments, à condition que des méthodes appropriées pour la différenciation des iPSC dans les MNs soient disponibles. Le raisonnement qui sous-tend le développement de cette méthode est de fournir à la communauté scientifique intéressée par les maladies MN un protocole de différenciation rapide et efficace donnant naissance à des MNs fonctionnelles matures. Le premier avantage de cette méthode est son délai d’exécution. Un autre point de force pertinent vient de l’élimination de toute étape de purification. Enfin, le protocole peut être utilisé pour générer deux populations distinctes de neurones moteurs.
La possibilité de générer différents sous-types de MNs est particulièrement pertinente pour la modélisation des maladies MN. Tous les sous-types de MN ne sont pas tout aussi vulnérables dans le SLA et le SMA et l’apparition des symptômes dans différentes unités motrices influe grandement sur le pronostic. Dans l’ALS, l’apparition spinale avec des symptômes commençant dans les membres supérieurs et inférieurs conduit à la mort dans environ 3-5 ans4. Inversement, l’apparition de bulbardes, commençant par la dégénérescence des MNs crânienne, a un pronostic pire. En outre, le pourcentage d’apparition de bulbardes est significativement plus élevé chez les patients avec des mutations dans les protéines de liaison de l’ARN FUS et TDP-43 que chez les individus avec des mutations SOD15. Presque la totalité des protocoles alternatifs de différenciation du mn repose sur l’activité de l’acide rétinoïque (RA), qui confère un caractère spinal à la différenciation des ipscs6,7,8. Cela limite la possibilité d’étudier des facteurs intrinsèques, qui pourraient être protecteurs dans des sous-types de mn spécifiques9,10.
En accord avec un travail antérieur dans les cellules souches embryonnaires de souris11, nous avons récemment montré que dans l’expression ectopique d’ipscs humaine de Ngn2, Isl1 et LHX3 (Nil) induit une identité de mn spinale, tandis que Ngn2 et Isl1 plus PHOX2A (NIP) spécifient le MNS crânien12. Nous avons donc développé un protocole efficace, conduisant à la production de MNs humaines dotées de propriétés fonctionnelles dans un délai de 12 jours. Le but de cette méthode est d’obtenir, dans un court laps de temps et sans la nécessité de purification (par exemple, par FACS), les populations cellulaires hautement enrichi pour les MNs avec l’identité spinale ou crânienne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole permet de convertir efficacement les IPSC humains en neurones moteurs spinaux et crânien grâce à l’expression ectopique de facteurs de transcription spécifiques à la lignée. Ces transgènes sont inductibles par la doxycycline et sont intégrés de manière stable dans le génome grâce à un vecteur basé sur le transposon piggyBac. Dans une population mixte, une ou plusieurs copies du vecteur piggyBac seront intégrées au hasard dans le génome de cellules individuelles, augmentant ainsi le risque …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier le centre d’imagerie de Center for Life nano science, Istituto Italiano di Tecnologia, pour son soutien et ses conseils techniques. Nous sommes reconnaissants aux membres du Center for Life nano science pour la discussion utile. Ce travail a été partiellement appuyé par une subvention d’AriSLA (subvention pilote 2016 «StressFUS») à l’AR.
Materials
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | chemicals for electrophysiological solutions |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Cell dissociation reagent |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003 |
| anti-goat Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848 |
| anti-mouse Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130 |
| anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117 |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Immunological Sciences | IS-20152-1 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Serum free supplement for neuronal cell maintenance |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Brain-Derived Neurotrophic Factor |
| Blasticidin | Sigma-Aldrich | 203350 | Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Clampex 10 software | Molecular Devices | Clampex 10 | Membrane currents recording system |
| Corning Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports |
| CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA | Biological Industries | 05-710-1E | Freezing medium for human iPSCs |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5146 | chemicals for electrophysiological solutions |
| DAPI powder | Roche | 10236276001 | 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Gamma secretase inhibitor |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Basal medium for cell culture |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Commercial human iPSC line |
| E.Z.N.A Total RNA Kit | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Glial-Derived Neurotrophic Factor |
| Gibco Episomal hiPSC Line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Commercial human iPSC line |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health. |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | chemicals for electrophysiological solutions |
| iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | Kit for gene expression analysis using real-time qPCR |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument |
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | chemicals for electrophysiological solutions |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | chemicals for electrophysiological solutions |
| L-ascorbic acid | LKT Laboratories | A7210 | Used in cell culture as an antioxidant |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | iX83 FluoView1200 | Confocal microscope for acquisition of immunostaining images |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | chemicals for electrophysiological solutions |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Mounting Medium | Ibidi | 50001 | Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays |
| Multiclamp patch-clamp amplifier | Molecular Devices | 700B | Membrane currents recording system |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability. |
| Neon 100 μL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Cell electroporation kit |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Cell electroporation system |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer |
| NutriStem-XF/FF | Biological Industries | 05-100-1A | Human iPSC culture medium |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | Used for cell fixation in immunostaining assays |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium |
| PBS Ca2+/Mg2+ free | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria. |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays |
| Upright microscope | Olympus | BX51VI | Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival |
| μ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Support for high–end microscopic analysis of fixed cells |
References
- Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
- Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
- Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
- Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
- Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
- Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
- Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
- Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960 (2016).
- Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
- De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
- Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
- Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
- Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
- Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
- Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
- Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).
