Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren
Summary
Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und effiziente Umwandlung von induzierten pluripotenten Stammzellen in motorische Neuronen mit einer Wirbelsäulen-oder Schädelidentität, indem es die Transkriptionsfaktoren von induzierbaren PiggyBac-Vektoren ausführt.
Abstract
Wir beschreiben hier eine Methode, um funktionelle Wirbelsäulen-und Schädelmotor-Neuronen aus vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zu erhalten. Die direkte Umwandlung in Motorneuron erfolgt durch die ektopische Expression alternativer Module von Transkriptionsfaktoren, nämlich Ngn2, Isl1 und Lhx3 (NIL) oder Ngn2, Isl1 und Phox2a (NIP). NIL und NIP geben jeweils die Identität des Wirbelsäulen-und Schädelmotors Neuron an. Unser Protokoll beginnt mit der Generierung von modifizierten iPSC-Leitungen, bei denen NIL oder NIP über einen PiggyBac-Transpospo-Vektor stabil in das Genom integriert sind. Die Expression der Transgene wird dann durch Doxycyclin induziert und führt in 5 Tagen zur Umwandlung von iPSCs in MN-Vorläufer. Die anschließende Reifung führt zu einer homogenen Population von Wirbelsäulen-oder Schädelmlassen. Unsere Methode hat gegenüber früheren Protokollen mehrere Vorteile: Sie ist extrem schnell und vereinfacht; Es erfordert keine Virusinfektion oder eine weitere MN-Isolierung; Es ermöglicht die Erzeugung von verschiedenen MN-Subpopulationen (Wirbelsäule und Schädelung) mit einem bemerkenswerten Reifungsgrad, wie die Fähigkeit zeigt, Züge von Aktionspotenzialen zu befeuern. Darüber hinaus kann eine große Anzahl von motorischen Neuronen ohne Reinigung von gemischten Populationen gewonnen werden. Die iPSC-abgeleiteten Wirbelsäulen-und Schädelmotor-Neuronen können für die In-vitro-Modellierung der amyotrophen Lateralsklerose und anderer neurodegenerativer Erkrankungen des motorischen Neurons eingesetzt werden. Homogene motorische Neuronenpopulationen könnten eine wichtige Ressource für zelltypspezifische Arzneimittel-Screenings darstellen.
Introduction
Motor-Neuron (MN) Degeneration spielt eine ursächliche Rolle bei menschlichen Erkrankungen wie der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) und der Wirbelsäulenmuskulären Atrophie (SMA). Die Etablierung geeigneter In-vitro-Zellmodellsysteme, die die Komplexität des menschlichen MN rekapitulieren, ist ein wichtiger Schritt zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze. Ausgeführte pluripotente Stammzellen (iPSCs), die mit bemerkenswerten Plurilinage-Differenzierungseigenschaften ausgestattet sind, stammen inzwischen von einer Reihe von Patienten, die von motorischen Neuronenkrankheiten 1,2betroffen sind. Zusätzliche iPSC-Linien, die pathogene Mutationen im Zusammenhang mit MN-Erkrankungen tragen, wurden durch die Genbearbeitung erzeugt, angefangen von der Kontrolle “gesunder” pluripotenter Stammzellen 3. Diese Linien stellen nützliche Werkzeuge für die Modellierung von In-vitro-Krankheiten und das Arzneimittelscreening dar, vorausgesetzt, dass geeignete Methoden für die iPSC-Figierung in MNs zur Verfügung stehen. Die Begründung für die Entwicklung dieser Methode besteht darin, der an PN-Krankheiten interessierten wissenschaftlichen Gemeinschaft ein schnelles und effizientes Differenzierungsprotokoll zu bieten, das zu reifen funktionellen MNs führt. Der erste Vorteil dieser Methode ist der Zeitrahmen der Ausführung. Ein weiterer relevanter Punkt der Stärke ist die Beseitigung eines Reinigungsschrittes. Schließlich kann das Protokoll verwendet werden, um zwei verschiedene Populationen von motorischen Neuronen zu erzeugen.
Die Möglichkeit, verschiedene Subtypen von MNs zu erzeugen, ist besonders für die Modellierung von MN-Erkrankungen relevant. Nicht alle MN-Subtypen sind in ALS und SMA gleich anfällig und das Auftreten von Symptomen in verschiedenen Motoreinheiten beeinflusst die Prognose stark. Bei ALS führt der Wirbelsäuleneintritt mit Symptomen, die in der oberen und unteren Gliedmaßen beginnen, in etwa 3-5 Jahren 4 zum Tod. Umgekehrt hat der Bulbar-Auftakt, beginnend mit der Degeneration der Schädelmähne, eine schlechteste Prognose. Darüber hinaus ist der Anteil des Bulbar-Ansatzes bei Patienten mit Mutationen in den RNA-bindenden Proteinen FUS und TDP-43 signifikanthöherals bei Personen mit SOD1-Mutationen 5. Fast die Gesamtheit alternativer MN-Differenzierungsprotokolle beruht auf der Aktivität der Retinosäure (RA), die der Differenzierung von iPSCs6,7,8einenWirbelsäulencharakter verleiht. Dies schränkt die Möglichkeit ein, intrinsische Faktorenzuuntersuchen, die in bestimmten PN-Subtypen 9,10Schutz bieten könnten.
Im Einklang mit einer früheren Arbeit in der Maus embryonalen Stammzellen11, Wir haben vor kurzem gezeigt, dass in menschlichen iPSCs ectopischen Ausdruck von Ngn2, Isl1 und Lhx3 (NIL) induziert eine Wirbelsäulen-MN-Identität, während Ngn2 und Isl1 plus Phox2a (NIP) angeben,kranial MNs 12. Deshalb haben wir ein effizientes Protokoll entwickelt, das zur Produktion von menschlichen MNs führt, die in einem 12-tägigen Turnaround mit funktionalen Eigenschaften ausgestattet sind. Ziel dieser Methode ist es, in kurzer Zeit und ohne Reinigungsbedarf (z.B. durch FACS) Zellpopulationen zu erhalten, die für MNs mit Wirbelsäulen-oder Schädelidentität hoch angereichert sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll ermöglicht es, menschliche iPSCs dank der ektopischen Expression von linearpezifischen Transkriptionsfaktoren effizient in Wirbelsäulen-und Schädelmotorneuronen umzuwandeln. Diese Transgene sind durch Doxycyclin induzierbar und dank eines Transpokortvektors auf Sparkug stabil in das Genom integriert. In einer gemischten Population wird ein oder mehrere Exemplare des Huckepitschwein-Vektors nach dem Zufallsprinzip in das Genom einzelner Zellen integriert, was das Risiko von Veränderungen der Genominte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der Imaging Facility at Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, für die Unterstützung und technische Beratung. Wir danken den Mitgliedern des Center for Life Nano Science für die hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Stipendium von AriSLA (Pilotstipendium 2016 “StressFUS”) an AR unterstützt.
Materials
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | chemicals for electrophysiological solutions |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Cell dissociation reagent |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003 |
| anti-goat Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848 |
| anti-mouse Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130 |
| anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117 |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Immunological Sciences | IS-20152-1 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Serum free supplement for neuronal cell maintenance |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Brain-Derived Neurotrophic Factor |
| Blasticidin | Sigma-Aldrich | 203350 | Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Clampex 10 software | Molecular Devices | Clampex 10 | Membrane currents recording system |
| Corning Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports |
| CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA | Biological Industries | 05-710-1E | Freezing medium for human iPSCs |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5146 | chemicals for electrophysiological solutions |
| DAPI powder | Roche | 10236276001 | 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Gamma secretase inhibitor |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Basal medium for cell culture |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Commercial human iPSC line |
| E.Z.N.A Total RNA Kit | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Glial-Derived Neurotrophic Factor |
| Gibco Episomal hiPSC Line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Commercial human iPSC line |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health. |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | chemicals for electrophysiological solutions |
| iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | Kit for gene expression analysis using real-time qPCR |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument |
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | chemicals for electrophysiological solutions |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | chemicals for electrophysiological solutions |
| L-ascorbic acid | LKT Laboratories | A7210 | Used in cell culture as an antioxidant |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | iX83 FluoView1200 | Confocal microscope for acquisition of immunostaining images |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | chemicals for electrophysiological solutions |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Mounting Medium | Ibidi | 50001 | Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays |
| Multiclamp patch-clamp amplifier | Molecular Devices | 700B | Membrane currents recording system |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability. |
| Neon 100 μL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Cell electroporation kit |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Cell electroporation system |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer |
| NutriStem-XF/FF | Biological Industries | 05-100-1A | Human iPSC culture medium |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | Used for cell fixation in immunostaining assays |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium |
| PBS Ca2+/Mg2+ free | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria. |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays |
| Upright microscope | Olympus | BX51VI | Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival |
| μ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Support for high–end microscopic analysis of fixed cells |
References
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