मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) कार्यात्मक रीढ़ की हड्डी और कपालीय मोटर ंयूरॉंस में PiggyBac वैक्टर का उपयोग में परिवर्तन
Summary
इस प्रोटोकॉल एक रीढ़ की हड्डी या कपाल पहचान के साथ मोटर ंयूरॉंस में प्रेरित pluripotent स्टेम सेल के तेजी से और कुशल रूपांतरण की अनुमति देता है, inducible piggybac वैक्टर से प्रतिलेखन कारकों की अस्थानिक अभिव्यक्ति द्वारा ।
Abstract
हम यहां मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) से कार्यात्मक रीढ़ की हड्डी और कपाल मोटर ंयूरॉंस प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन । मोटर न्यूरॉन में प्रत्यक्ष रूपांतरण प्रतिलेखन कारकों के वैकल्पिक मॉड्यूल, अर्थात् Ngn2, Isl1 और Lhx3 (शूंय) या Ngn2, Isl1 और Phox2a (एनआईपी) के अस्थानिक अभिव्यक्ति द्वारा प्राप्त की है । शून्य और चुटकी क्रमश: स्पाइनल और कपालीय मोटर न्यूरॉन पहचान निर्दिष्ट करें. हमारा प्रोटोकॉल संशोधित iPSC लाइनों के उत्पादन के साथ शुरू होता है जिसमें शून्य या चुटकी एक piggyBac ट्रांससन वेक्टर के माध्यम से जीनोम में stably एकीकृत कर रहे हैं । इसके बाद, 5 दिनों में, आईपीएससी को एमएन प्रजनकों में परिवतत करने के लिए ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति को डॉक्क्साइलीन और लीड्स द्वारा प्रेरित किया जाता है । बाद में परिपक्वता, 7 दिनों के लिए, रीढ़ की हड्डी या कपालीय MNs की सजातीय आबादी की ओर जाता है । हमारे विधि पिछले प्रोटोकॉल पर कई लाभ रखती है: यह बहुत तेजी से और सरल है; यह वायरल संक्रमण या आगे एमएन अलगाव की आवश्यकता नहीं है; यह विभिन्न MN subpopulations या (रीढ़ की हड्डी और कपाल) एक उल्लेखनीय डिग्री के साथ पैदा करने की अनुमति देता है, के रूप में कार्रवाई की क्षमता की गाड़ियों को आग करने के लिए योग्यता का प्रदर्शन. इसके अलावा, मिश्रित आबादी से शुद्धि के बिना मोटर ंयूरॉंस की एक बड़ी संख्या में प्राप्त किया जा सकता है । iPSC-व्युत्पंन रीढ़ की हड्डी और कपाल मोटर ंयूरॉंस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस और अंय neurodegenerative मोटर न्यूरॉन के रोगों के इन विट्रो मॉडलिंग । सजातीय मोटर ंयूरॉन आबादी कोशिका प्रकार विशिष्ट दवा स्क्रीनिंग के लिए एक महत्वपूर्ण संसाधन का प्रतिनिधित्व हो सकता है ।
Introduction
मोटर न्यूरॉन (MN) अध: पतन मानव रोगों जैसे कि Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS) और स्पाइनल मस्कुलर शोष (SMA) में एक प्रेरणाकारक भूमिका निभाता है । मानव MN की जटिलता को पुनर्गृहीत करने वाले इन विट्रो सेल मॉडल सिस्टम में उपयुक्त स्थापना करना नए चिकित्सीय दृष्टिकोणों के विकास की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है । प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (ipscs), जो उल्लेखनीय अनेकवंशीय भेदभाव गुणों के साथ संपंन कर रहे हैं, अब मोटर ंयूरॉन रोग1,2से प्रभावित रोगियों की संख्या से व्युत्पंन किया गया है । जीएमएन रोगों से जुड़े रोगजनक उत्परिवर्तनों को लेकर अतिरिक्त iPSC लाइनें जीन संपादन द्वारा उत्पन्न किया गया है, नियंत्रण से शुरू “स्वस्थ” pluripotent स्टेम सेल3. इन विट्रो रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं, बशर्ते कि MNs में iPSC विभेदन के लिए उचित तरीके उपलब्ध हैं । इस पद्धति के विकास के पीछे तर्क यह है कि वैज्ञानिक समुदाय को एक तेज और कुशल विभेदन प्रोटोकॉल के साथ एमएन रोगों में रुचि प्रदान करने के लिए परिपक्व कार्यात्मक एमएनएस को जंम दे रही है । इस विधि का पहला लाभ निष्पादन की अपनी समय सीमा है । शक्ति का एक अंय प्रासंगिक बिंदु किसी भी शुद्धि कदम के उंमूलन से आता है । अंत में, प्रोटोकॉल मोटर ंयूरॉंस के दो अलग आबादी उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
एमएनएस के विभिन्न उपप्रकारों के सृजन की संभावना विशेष रूप से एमएन रोगों की मॉडलिंग के लिए प्रासंगिक है । नहीं सभी MN उपप्रकार ALS और SMA में समान रूप से कमजोर कर रहे हैं और विभिन्न मोटर इकाइयों में लक्षण की शुरुआत बहुत रोग का निदान को प्रभावित करता है. ALS में, ऊपरी और निचले अंगों में शुरू लक्षण के साथ रीढ़ की हड्डी में शुरुआत के बारे में 3-5 साल4में मौत की ओर जाता है । इसके विपरीत, कंदाकार शुरुआत, कपाल MNs के पतन के साथ शुरू, एक सबसे बुरा पूर्वानुमान है. इसके अलावा, कंदाकार शुरुआत का प्रतिशत आरएनए में उत्परिवर्तनों के साथ रोगियों में काफी अधिक है-बाध्यकारी प्रोटीन fus और तेदेपा-४३ SOD1 उत्परिवर्तन5के साथ व्यक्तियों में से । वैकल्पिक MN विभेदन प्रोटोकॉल के लगभग समग्रता रेटिनॉइक एसिड की गतिविधि पर निर्भर करता है (आरए), जो एक रीढ़ की हड्डी को ipscs6,7,8फर्क करने के लिए प्रदान करते हैं । यह आंतरिक कारकों का अध्ययन करने की संभावना को सीमित करता है, जो विशिष्ट MN उप प्रकार9,10में सुरक्षात्मक हो सकता है ।
माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में पिछले एक काम के साथ संगत11, हम हाल ही में दिखाया है कि मानव Ipscs में Ngn2 की एक्टॉपिक अभिव्यक्ति, Isl1 और LHX3 (शूंय) एक रीढ़ की हड्डी MN पहचान लाती है, जबकि Ngn2 और Isl1 प्लस Phox2a (एनआईपी) निर्दिष्ट कपाल MNs12। हम इसलिए एक कुशल प्रोटोकॉल विकसित किया है, एक 12 दिनों के बदलाव में कार्यात्मक गुणों के साथ संपंन मानव MNs के उत्पादन के लिए अग्रणी । इस विधि के प्रयोजन के लिए एक कम समय सीमा में प्राप्त करने के लिए और शुद्धि के लिए आवश्यकता के बिना (जैसे, FACS द्वारा), सेल अत्यधिक रीढ़ की हड्डी या कपाल पहचान के साथ MNs के लिए समृद्ध आबादी है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल को कुशलता से रीढ़ की हड्डी और कपाल मोटर ंयूरॉंस धंयवाद में मानव ipscs वंश-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्शन कारकों की अस्थानिक अभिव्यक्ति को बदलने की अनुमति देता है । इन transgenes doxycycline और stably एक piggyBac पक्षासन आध?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के जीवन नैनो विज्ञान के लिए केंद्र में इमेजिंग सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, Isरवैए को Italiano di Tecnologia, समर्थन और तकनीकी सलाह के लिए । हम उपयोगी चर्चा के लिए जीवन नैनो विज्ञान के लिए केंद्र के सदस्यों के लिए आभारी हैं । यह कार्य आंशिक रूप से एक अनुदान द्वारा AriSLA (पायलट अनुदान २०१६ “StressFUS”) AR करने के लिए समर्थित किया गया था ।
Materials
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | chemicals for electrophysiological solutions |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Cell dissociation reagent |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003 |
| anti-goat Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848 |
| anti-mouse Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130 |
| anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117 |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Immunological Sciences | IS-20152-1 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Serum free supplement for neuronal cell maintenance |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Brain-Derived Neurotrophic Factor |
| Blasticidin | Sigma-Aldrich | 203350 | Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Clampex 10 software | Molecular Devices | Clampex 10 | Membrane currents recording system |
| Corning Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports |
| CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA | Biological Industries | 05-710-1E | Freezing medium for human iPSCs |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5146 | chemicals for electrophysiological solutions |
| DAPI powder | Roche | 10236276001 | 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Gamma secretase inhibitor |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Basal medium for cell culture |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Commercial human iPSC line |
| E.Z.N.A Total RNA Kit | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Glial-Derived Neurotrophic Factor |
| Gibco Episomal hiPSC Line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Commercial human iPSC line |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health. |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | chemicals for electrophysiological solutions |
| iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | Kit for gene expression analysis using real-time qPCR |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument |
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | chemicals for electrophysiological solutions |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | chemicals for electrophysiological solutions |
| L-ascorbic acid | LKT Laboratories | A7210 | Used in cell culture as an antioxidant |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | iX83 FluoView1200 | Confocal microscope for acquisition of immunostaining images |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | chemicals for electrophysiological solutions |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Mounting Medium | Ibidi | 50001 | Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays |
| Multiclamp patch-clamp amplifier | Molecular Devices | 700B | Membrane currents recording system |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability. |
| Neon 100 μL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Cell electroporation kit |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Cell electroporation system |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer |
| NutriStem-XF/FF | Biological Industries | 05-100-1A | Human iPSC culture medium |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | Used for cell fixation in immunostaining assays |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium |
| PBS Ca2+/Mg2+ free | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria. |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays |
| Upright microscope | Olympus | BX51VI | Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival |
| μ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Support for high–end microscopic analysis of fixed cells |
References
- Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
- Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
- Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
- Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
- Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
- Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
- Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
- Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960 (2016).
- Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
- De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
- Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
- Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
- Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
- Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
- Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
- Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).
