Conversione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) in neuroni motore spinale e cranico funzionale utilizzando vettori PiggyBac
Summary
Questo protocollo consente la conversione rapida ed efficiente delle cellule staminali pluripotenti indotte in neuroni motori con un’identità spinale o cranica, mediante l’espressione ectopica dei fattori di trascrizione dai vettori inducibili piggyBac.
Abstract
Descriviamo qui un metodo per ottenere funzionali neuroni motori spinale e craniale da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (IPSC). La conversione diretta in motore neurone è ottenuta per espressione ectopica di moduli alternativi di fattori di trascrizione, vale a dire Ngn2, Isl1 e Lhx3 (NIL) o Ngn2, Isl1 e Phox2a (NIP). NIL e NIP specificano, rispettivamente, l’identità del motore neuronale spinale e craniale. Il nostro protocollo inizia con la generazione di linee iPSC modificate in cui NIL o NIP sono stabilmente integrati nel genoma tramite un vettore di trasposizione piggyBac. L’espressione dei transgeni viene quindi indotta dalla doxiciclina e conduce, in 5 giorni, alla conversione degli iPSCs in progenitori MN. La successiva maturazione, per 7 giorni, conduce a popolazioni omogenee di MNs spinale o craniale. Il nostro metodo contiene diversi vantaggi rispetto ai protocolli precedenti: è estremamente rapido e semplificato; non richiede infezione virale o ulteriore isolamento MN; permette di generare diverse sottopopolazioni MN (spinali e craniche) con un notevole grado di maturazione, come dimostrato dalla capacità di sparare i treni dei potenziali d’azione. Inoltre, un gran numero di motoneuroni può essere ottenuto senza purificazione da popolazioni miste. i neuroni del motore spinale e craniale derivati da iPSC possono essere utilizzati per la modellazione in vitro della sclerosi laterale amiotrofico e di altre malattie neurodegenerative del Neuron motorio. Le popolazioni di neuroni omogenei del motore potrebbero rappresentare una risorsa importante per proiezioni di farmaci specifici per tipo di cellula.
Introduction
La degenerazione del motoneurico (MN) svolge un ruolo causale nelle malattie umane come la sclerosi laterale amiotrofico (ALS) e l’atrofia muscolare spinale (SMA). La creazione di sistemi di modelli cellulari idonei in vitro che ricapitolano la complessità del MN umano è un passo importante verso lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), che sono dotate di notevoli proprietà di differenziazione plurilineage, sono state ora derivate da un numero di pazienti affetti da malattie motoneuriche1,2. Ulteriori linee iPSC che trasportano mutazioni patogene associate a malattie MN sono state generate dall’editing genico, partendo dal controllo delle cellule staminali pluripotenti “sane”3. Queste linee rappresentano strumenti utili per la modellazione delle malattie in vitro e lo screening dei farmaci, purché siano disponibili metodi appropriati per la differenziazione iPSC in MNs. La logica alla base dello sviluppo di questo metodo è quella di fornire alla comunità scientifica interessata alle malattie MN un protocollo di differenziazione veloce ed efficiente che dà origine a MNs funzionali maturi. Il primo vantaggio di questo metodo è il suo lasso di tempo di esecuzione. Un altro punto di forza rilevante deriva dall’eliminazione di qualsiasi fase di purificazione. Infine, il protocollo può essere utilizzato per generare due distinte popolazioni di motoneuroni.
La possibilità di generare diversi sottotipi di MNs è particolarmente rilevante per la modellazione delle malattie MN. Non tutti i sottotipi MN sono ugualmente vulnerabili in ALS e SMA e l’insorgenza dei sintomi in diverse unità motoria influisce notevolmente sulla prognosi. Nella SLA, l’esordio spinale con sintomi che iniziano negli arti superiori e inferiori conduce alla morte in circa 3-5 anni4. Al contrario, l’insorgenza di bulbare, a cominciare dalla degenerazione di MNs craniali, ha una prognosi peggiore. Inoltre, la percentuale di insorgenza di bulbare è significativamente più alta nei pazienti con mutazioni nelle proteine leganti l’RNA FUS e TDP-43 rispetto agli individui con mutazioni SOD15. Quasi la totalità dei protocolli alternativi di differenziazione MN si basa sull’attività dell’acido retinoico (RA), che conferisce un carattere spinale per differenziare iPSCs6,7,8. Ciò limita la possibilità di studiare fattori intrinseci, che potrebbero essere protettivi in specifici sottotipi di MN9,10.
Coerentemente con un precedente lavoro in cellule staminali embrionali di topo11, abbiamo recentemente dimostrato che nell’espressione ectopica iPSCs umana di Ngn2, Isl1 e LHX3 (Nil) induce un’identità spinale MN, mentre Ngn2 e Isl1 più PHOX2A (NIP) specificano MNS craniali12. Abbiamo quindi sviluppato un protocollo efficiente, che porta alla produzione di MNs umani dotati di proprietà funzionali in un turnaround di 12 giorni. Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere, in un breve lasso di tempo e senza la necessità di purificazione (ad esempio, da FACS), popolazioni di cellule altamente arricchite per gli MNs con identità spinale o craniale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo consente di convertire efficacemente gli IPSC umani in neuroni motori spinali e cranici grazie all’espressione ectopica di fattori di trascrizione specifici per lignaggio. Questi transgeni sono inducibili dalla doxiciclina e stabilmente integrati nel genoma grazie a un vettore basato su trasposti piggyBac. In una popolazione mista, una o più copie del vettore piggyBac saranno integrate in modo casuale nel genoma delle singole cellule, aumentando il rischio di alterazioni dell’integrità del genoma. Ino…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare l’imaging Facility presso Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di tecnologia, per il supporto e la consulenza tecnica. Siamo grati ai membri del centro per la vita Nano Science per una discussione utile. Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da una sovvenzione di AriSLA (Pilot Grant 2016 “StressFUS”) all’AR.
Materials
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | chemicals for electrophysiological solutions |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Cell dissociation reagent |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003 |
| anti-goat Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848 |
| anti-mouse Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130 |
| anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117 |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Immunological Sciences | IS-20152-1 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Serum free supplement for neuronal cell maintenance |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Brain-Derived Neurotrophic Factor |
| Blasticidin | Sigma-Aldrich | 203350 | Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Clampex 10 software | Molecular Devices | Clampex 10 | Membrane currents recording system |
| Corning Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports |
| CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA | Biological Industries | 05-710-1E | Freezing medium for human iPSCs |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5146 | chemicals for electrophysiological solutions |
| DAPI powder | Roche | 10236276001 | 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Gamma secretase inhibitor |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Basal medium for cell culture |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Commercial human iPSC line |
| E.Z.N.A Total RNA Kit | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Glial-Derived Neurotrophic Factor |
| Gibco Episomal hiPSC Line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Commercial human iPSC line |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health. |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | chemicals for electrophysiological solutions |
| iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | Kit for gene expression analysis using real-time qPCR |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument |
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | chemicals for electrophysiological solutions |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | chemicals for electrophysiological solutions |
| L-ascorbic acid | LKT Laboratories | A7210 | Used in cell culture as an antioxidant |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | iX83 FluoView1200 | Confocal microscope for acquisition of immunostaining images |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | chemicals for electrophysiological solutions |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Mounting Medium | Ibidi | 50001 | Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays |
| Multiclamp patch-clamp amplifier | Molecular Devices | 700B | Membrane currents recording system |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability. |
| Neon 100 μL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Cell electroporation kit |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Cell electroporation system |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer |
| NutriStem-XF/FF | Biological Industries | 05-100-1A | Human iPSC culture medium |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | Used for cell fixation in immunostaining assays |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium |
| PBS Ca2+/Mg2+ free | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria. |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays |
| Upright microscope | Olympus | BX51VI | Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival |
| μ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Support for high–end microscopic analysis of fixed cells |
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