Summary

PiggyBac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換

Published: May 01, 2019
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Summary

このプロトコルは、誘導性 piggyBac ベクターからの転写因子を異所的に発現することによって、脊髄または頭蓋の同一性を有する運動ニューロンへの誘発多能性幹細胞の迅速かつ効率的な変換を可能にする。

Abstract

ここではヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) から機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンを得る方法について述べる。運動ニューロンへの直接変換は、転写因子、すなわち Ngn2、Isl1 および Lhx3 (NIL) または Ngn2、Isl1 および Phox2a (ニップ) の代替モジュールの異所性発現によって得られる。NIL およびニップは、それぞれ、脊髄および頭蓋運動ニューロン同一性を指定する。私たちのプロトコルは、piggyBac トランスポゾンベクターを介して、NIL またはニップがゲノム内に安定して統合される修飾 iPSC 線の生成から始まる。トランスジーンの発現は、その後、ドキシサイクリンおよびリードによって誘発され、5日で、iPSCs の MN 前駆細胞への転化に移行する。その後の成熟は、7日間、脊椎または頭蓋の MNs の均質な集団をもたらす。私たちの方法は、以前のプロトコルよりもいくつかの利点を保持します: それは非常に迅速かつ単純化されます。これは、ウイルス感染またはさらに MN 分離を必要としません;これは、アクション電位の列車を発射する能力によって示されるように、成熟の顕著な程度で異なる MN 亜集団 (脊髄および頭蓋) を生成することができます。さらに、混合集団から精製することなく多数の運動ニューロンを得ることができる。iPSC 由来の脊髄および頭蓋運動ニューロンは、筋萎縮性側索硬化症および運動ニューロンの他の神経変性疾患のインビトロモデリングに使用することができる。同種運動ニューロン集団は、細胞型特異的薬物スクリーニングのための重要な資源を表すかもしれない。

Introduction

運動ニューロン (MN) 変性は、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) や脊髄筋萎縮 (SMA) などのヒト疾患において原因となる役割を果たしている。ヒト MN の複雑性を不在するインビトロ細胞モデルシステムを確立することは、新しい治療アプローチの開発に向けた重要なステップである。顕著な plurilineage 分化特性を授けられている誘導多能性幹細胞 (iPSCs) は、現在、運動ニューロン疾患1,2によって影響を受ける多くの患者に由来している。MN 疾患に関連した病原性変異を運ぶ付加的な iPSC 線は、遺伝子編集によって生成されており、制御「健常な」多能性幹細胞3から始まる。これらの線は、インビトロ疾患モデリングおよび薬物スクリーニングのための有用なツールを表し、MNs への iPSC 分化のための適切な方法が利用可能であることを提供する。この方法の開発の背後にある理論的根拠は、成熟した機能 MNs を生み出す高速かつ効率的な分化プロトコルで MN 疾患に興味を持って科学的なコミュニティを提供することです。この方法の最初の利点は、実行の時間枠です。強度の別の関連するポイントは、任意の精製工程の排除から来ています。最後に、プロトコルは、運動ニューロンの2つの異なる集団を生成するために使用することができます。

MNs の異なるサブタイプを生成する可能性は、特に MN 疾患のモデル化に関連している。すべての MN 亜型は、ALS および SMA において同様に脆弱であり、異なる運動単位での症状の発症は、予後に大きく影響する。ALS において、上肢および下肢において始まる症状を伴う脊髄発症は、約3-5 年で死に至る4.逆に、球性発症は、頭蓋 MNs の変性から始まり、最悪の予後を有する。さらに、球性発症の割合は、SOD1 変異5を有する個体に比べて RNA 結合タンパク質 FUS および TDP-43 の突然変異を有する患者において有意に高い。代替 MN 分化プロトコールのほぼ全体は、レチノイン酸 (RA) の活性に依存しており、iPSCs678の鑑別に脊髄特性を付与する。これは、特定の MN 亜型9,10で保護することができる内因性因子を研究する可能性を制限します。

マウス胚性幹細胞11における以前の作業と一致して、我々は最近、ヒトの iPSCs 異所の Ngn2、Isl1 および LHX3 (NIL) が脊髄 MN 同一性を誘導するのに、Ngn2 および Isl1 プラス PHOX2A(ニップ) を頭蓋 MNs を指定することを示した。従って私達はそれ故に12日の転換の機能特性と恵まれた人間の MNs の生産に導く有効な議定書を開発した。この方法の目的は、短時間で、精製を必要とせずに (例えば、FACS によって) 得ることであり、細胞集団は脊髄または頭蓋の同一性を有する MNs に対して高度に濃縮された。

Protocol

1. 人間の iPSCs の維持 マトリックスコーティングプレートの調製 4° c のマトリクス (材料の表を参照) の1つの 5 mL バイアルを一晩解凍します。元のマトリックス株は異なるストック濃度で来て、アリコートは個々のロットに特異的なデータシートに示された希釈倍率に従って作られる。マトリックスの早期ゲル化を防ぐためにバイアルとチューブの氷?…

Representative Results

この分化方法の概略説明を図 1に示す。ヒト iPSCs (WT I ライン3) は、EpB-BSD-TT-NIL または EpB-BSD-TT-ニップを用いてトランスフェクトし、ブラスチシジン選択に際して、安定かつ誘導的な細胞株12を、それぞれ iPSC-NIL および iPSC-ニップと称する。分化細胞は、多能性マーカー OCT4 と汎神経マーカー TUJ1 の発現について特徴付けられた。免疫?…

Discussion

このプロトコルは、系統特異的転写因子の異所性発現のおかげで、ヒト iPSCs を脊髄および頭蓋運動ニューロンに効率的に変換することを可能にする。これらのトランスジーンはドキシサイクリンによって誘導され、piggyBac のトランスポゾンベースのベクターのおかげでゲノムに安定的に組み込まれる。混合集団では、piggyBac ベクターの1つまたは複数のコピーが個々の細胞のゲノムにランダ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、サポートと技術的なアドバイスのための生命ナノサイエンス、Istituto イタリアディ Tecnologia のためのセンターでイメージング施設に感謝したいと思います。私たちは、有益な議論のための生命ナノ科学センターのメンバーに感謝しています。この作業は、AriSLA (パイロットグラント 2016 “StressFUS”) から AR への助成金によって部分的にサポートされました。

Materials

5-Bapta Sigma-Aldrich A4926-1G chemicals for electrophysiological solutions
Accutase Sigma-Aldrich A6964-100ML  Cell dissociation reagent
anti-CHAT EMD Millipore  AB144P Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003
anti-goat Alexa Fluor 488  Thermo Fisher Scientific  A11055 Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848
anti-mouse Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific  A31571 Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130
anti-Oct4  BD Biosciences 611202 Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722
anti-Phox2b Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-376997 Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117
anti-rabbit Alexa Fluor 594  Immunological Sciences IS-20152-1 Secondary antibody used for immonofluorescence assays
anti-TUJ1  Sigma-Aldrich  T2200 Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133
B27 Miltenyi Biotec 130-093-566 Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker Nippon Genetics NGE-BB02 Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors
BDNF PreproTech 450-02 Brain-Derived Neurotrophic Factor
Blasticidin Sigma-Aldrich 203350 Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes
BSA Sigma-Aldrich A2153 Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 chemicals for electrophysiological solutions
Clampex 10 software Molecular Devices Clampex 10 Membrane currents recording system
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix Corning 354277 Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA Biological Industries 05-710-1E Freezing medium for human iPSCs
D-Glucose Sigma-Aldrich G5146 chemicals for electrophysiological solutions
DAPI powder Roche 10236276001 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays
DAPT AdipoGen AG-CR1-0016-M005 Gamma secretase inhibitor
Dispase Gibco 17105-041 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12 Sigma-Aldrich D6421-500ML Basal medium for cell culture
Doxycycline Sigma-Aldrich D9891-1G  Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U  WiCell UWWC1-DS2U Commercial human iPSC line
E.Z.N.A Total RNA Kit  Omega bio-tek R6834-02 Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells
GDNF PreproTech 450-10 Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line Thermo Fisher Scientific A18945 Commercial human iPSC line
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050038 An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.
Hepes Sigma-Aldrich H4034 chemicals for electrophysiological solutions
iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR  Bio-Rad 1708841 Kit for gene expression analysis using real-time qPCR
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix  Bio-Rad 172-5121  Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument
K-Gluconate Sigma-Aldrich G4500 chemicals for electrophysiological solutions
KCl Sigma-Aldrich P9333 chemicals for electrophysiological solutions
L-ascorbic acid LKT Laboratories A7210 Used in cell culture as an antioxidant
Laminin Sigma-Aldrich 11243217001 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Laser scanning confocal microscope  Olympus  iX83 FluoView1200 Confocal microscope for acquisition of immunostaining images
Mg-ATP Sigma-Aldrich A9187 chemicals for electrophysiological solutions
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 chemicals for electrophysiological solutions
Mounting Medium  Ibidi 50001 Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays
Multiclamp patch-clamp amplifier Molecular Devices 700B Membrane currents recording system
Na-GTP Sigma-Aldrich G8877 chemicals for electrophysiological solutions
NaCl Sigma-Aldrich 71376 chemicals for electrophysiological solutions
NEAA Thermo Fisher Scientific 11140035 Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 μL Kit Thermo Fisher Scientific MPK10096 Cell electroporation kit
Neon Transfection System Thermo Fisher Scientific MPK5000 Cell electroporation system
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103049 Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FF  Biological Industries 05-100-1A Human iPSC culture medium
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 157-8 Used for cell fixation in immunostaining assays
PBS Sigma-Aldrich D8662-500ML Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium
PBS Ca2+/Mg2+ free Sigma-Aldrich D8537-500ML Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium
Penicillin/Streptomycin  Sigma-Aldrich P4333-100ML Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
poly-ornithine Sigma-Aldrich P4957 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
SU5402 Sigma-Aldrich SML0443-5MG Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays
Upright microscope Olympus BX51VI Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera 
Y-27632  (ROCK inhibitor) Enzo Life Sciences ALX-270-333-M005  Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival
μ-Slide 8 Well  Ibidi 80826 Support for high–end microscopic analysis of fixed cells

References

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Garone, M. G., de Turris, V., Soloperto, A., Brighi, C., De Santis, R., Pagani, F., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors. J. Vis. Exp. (147), e59321, doi:10.3791/59321 (2019).

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