Konvertering av Human indusert pluripotent Stem Cells (iPSCs) i funksjonell spinal og skallen motor neurons bruke PiggyBac vektorer
Summary
Denne protokollen gir rask og effektiv konvertering av indusert Pluripotent stamceller i motoriske neurons med en spinal eller skallen identitet, ved svangerskap utenfor livmoren av transkripsjon faktorer fra induserbart piggyBac vektorer.
Abstract
Vi beskriver her en metode for å få funksjonell spinal og skallen motor neurons fra humant indusert Pluripotent stamceller (iPSCs). Direkte konvertering til motoriske nervecellen er oppnådd ved svangerskap utenfor livmoren uttrykk for alternative moduler av transkripsjon faktorer, nemlig Ngn2, Isl1 og Lhx3 (NIL) eller Ngn2, Isl1 og Phox2a (NIP). NIL og NIP spesifisere, henholdsvis, spinal og skallen motorisk Nevron identitet. Vår protokoll starter med generering av modifiserte iPSC linjer der NIL eller NIP er stabilt integrert i Genova via en piggyBac Transposon vektor. Uttrykk for transgenes blir deretter indusert av Doxycycline og fører, i 5 dager, til konvertering av iPSCs i MN forfedre. Påfølgende modning, for 7 dager, fører til homogene populasjoner av spinal eller skallen MNs. Vår metode har flere fordeler fremfor tidligere protokoller: det er ekstremt rask og forenklet; det krever ikke viral infeksjon eller ytterligere MN isolasjon; Det gjør det mulig å generere ulike MN subpopulasjoner (spinal og skallen) med en bemerkelsesverdig grad av modning, som demonstrert av evnen til brann tog av handlingen potensialer. Videre kan et stort antall motoriske neurons fås uten rensing fra blandede populasjoner. iPSC-avledet spinal og skallen motor neurons kan brukes til in vitro modellering av amyotrofisk lateral sklerose og andre nevrodegenerative sykdommer i motorisk Nevron. Homogen motorisk Nevron populasjoner kan representere en viktig ressurs for celle type bestemt legemiddel screenings.
Introduction
Motoriske Nevron (MN) degenerasjon spiller en utløsende rolle i menneskelige sykdommer som amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og spinal muskel atrofi (SMA). Etablering egnet in vitro celle modellsystemer som recapitulate kompleksiteten i den menneskelige MN er et viktig skritt mot utviklingen av nye terapeutiske tilnærminger. Indusert Pluripotent stamceller (iPSCs), som er utstyrt med bemerkelsesverdig plurilineage differensiering egenskaper, har nå blitt avledet fra en rekke pasienter rammet av motoriske Nevron sykdommer1,2. Ytterligere iPSC linjer bærer patogene mutasjoner knyttet til MN sykdommer har blitt generert av genredigering, fra kontroll “sunn” Pluripotent stamceller3. Disse linjene representerer nyttige verktøy for in vitro sykdom modellering og narkotika screening, forutsatt at hensiktsmessige metoder for iPSC differensiering inn MNs er tilgjengelig. Begrunnelsen for utviklingen av denne metoden er å gi det vitenskapelige samfunnet interessert i MN sykdommer med en rask og effektiv differensiering protokollen gir opphav til eldre funksjonell MNs. Den første fordelen med denne metoden er dens tidsramme for utførelse. En annen relevant punkt av styrke kommer fra eliminering av eventuelle rensing trinn. Endelig protokollen kan brukes til å generere to forskjellige populasjoner av motor neurons.
Muligheten for å generere ulike under typer av MNs er spesielt relevant for modellering av MN sykdommer. Ikke alle MN under typer er like sårbare i ALS og SMA og utbruddet av symptomene i ulike motor enheter i stor grad påvirker prognosen. I ALS, spinal utbruddet med symptomer som starter i øvre og nedre lemmer fører til døden i ca 3-5 år4. Omvendt, bulbar utbruddet, og starter med degenerasjon av skallen MNs, har en verste prognose. Videre er prosentandelen av bulbar utbruddet signifikant høyere hos pasienter med mutasjoner i RNA-bindende proteiner FUS og TDP-43 enn hos personer med SOD1 mutasjoner5. Nesten helheten av alternative MN differensiering protokoller er avhengig av aktiviteten til retinoic acid (ra), som tildeler en spinal karakter å skille iPSCs6,7,8. Dette begrenser muligheten for å studere indre faktorer, som kan være beskyttende i bestemte MN under typer9,10.
I samsvar med et tidligere arbeid i musen embryonale stamceller11, har vi nylig vist at i humant iPSCs svangerskap/Ngn2, Isl1 og LHX3 (Nil) induserer en spinal MN identitet, mens Ngn2 og Isl1 pluss PHOX2A (Nip) spesifiserer skallen MNs12. Vi har derfor utviklet en effektiv protokoll, som fører til produksjon av menneskelige MNs utstyrt med funksjonelle egenskaper i en 12 dagers behandlingstid. Hensikten med denne metoden er å få, i en kort tidsramme og uten behov for rensing (f. eks, av FACS), celle populasjoner svært beriket for MNs med spinal eller hjerne identitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen gjør det mulig å effektivt konvertere menneskelige iPSCs i spinal og skallen motor neurons takket være utenfor livmoren uttrykk for avstamning-spesifikke transkripsjon faktorer. Disse transgenes er induserbart av Doxycycline og stabilt integrert i Genova takket være en piggyBac Transposon-basert vektor. I en blandet befolkning, en eller flere eksemplarer av piggyBac vektoren vil bli tilfeldig integrert i Genova av individuelle celler, øker risikoen for Genova integritet endringer. Videre, en progre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Imaging Facility ved Center for Life nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, for støtte og tekniske råd. Vi er takknemlige for medlemmer av Center for Life nano Science for nyttig diskusjon. Dette arbeidet ble delvis støttet av et stipend fra AriSLA (pilot Grant 2016 “StressFUS”) til AR.
Materials
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | chemicals for electrophysiological solutions |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Cell dissociation reagent |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003 |
| anti-goat Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848 |
| anti-mouse Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130 |
| anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117 |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Immunological Sciences | IS-20152-1 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Serum free supplement for neuronal cell maintenance |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Brain-Derived Neurotrophic Factor |
| Blasticidin | Sigma-Aldrich | 203350 | Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Clampex 10 software | Molecular Devices | Clampex 10 | Membrane currents recording system |
| Corning Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports |
| CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA | Biological Industries | 05-710-1E | Freezing medium for human iPSCs |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5146 | chemicals for electrophysiological solutions |
| DAPI powder | Roche | 10236276001 | 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Gamma secretase inhibitor |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Basal medium for cell culture |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Commercial human iPSC line |
| E.Z.N.A Total RNA Kit | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Glial-Derived Neurotrophic Factor |
| Gibco Episomal hiPSC Line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Commercial human iPSC line |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health. |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | chemicals for electrophysiological solutions |
| iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | Kit for gene expression analysis using real-time qPCR |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument |
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | chemicals for electrophysiological solutions |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | chemicals for electrophysiological solutions |
| L-ascorbic acid | LKT Laboratories | A7210 | Used in cell culture as an antioxidant |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | iX83 FluoView1200 | Confocal microscope for acquisition of immunostaining images |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | chemicals for electrophysiological solutions |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Mounting Medium | Ibidi | 50001 | Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays |
| Multiclamp patch-clamp amplifier | Molecular Devices | 700B | Membrane currents recording system |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability. |
| Neon 100 μL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Cell electroporation kit |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Cell electroporation system |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer |
| NutriStem-XF/FF | Biological Industries | 05-100-1A | Human iPSC culture medium |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | Used for cell fixation in immunostaining assays |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium |
| PBS Ca2+/Mg2+ free | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria. |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays |
| Upright microscope | Olympus | BX51VI | Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival |
| μ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Support for high–end microscopic analysis of fixed cells |
References
- Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
- Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
- Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
- Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
- Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
- Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
- Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
- Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960 (2016).
- Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
- De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
- Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
- Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
- Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
- Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
- Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
- Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).
