Conversión de células madre pluripotentes inducidas por humanos (IPSC) en neuronas motoras craneales y espinales funcionales usando vectores PiggyBac
Summary
Este protocolo permite la conversión rápida y eficiente de células madre pluripotentes inducidas en neuronas motoras con una identidad espinal o craneal, mediante la expresión ectópica de factores de transcripción de vectores piggyBac inducibles.
Abstract
Describimos aquí un método para obtener neuronas motoras craneales y espinales funcionales a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (IPSC). La conversión directa en neurona motora se obtiene mediante la expresión ectópica de módulos alternativos de factores de transcripción, a saber, Ngn2, Isl1 y Lhx3 (NIL) o Ngn2, Isl1 y Phox2a (NIP). NIL y NIP especifican, respectivamente, la identidad de la neurona motora espinal y craneal. Nuestro protocolo comienza con la generación de líneas IPSC modificadas en las que Nil o NIP están integrados de forma estable en el genoma a través de un vector transposón piggybac. La expresión de los transgenes es inducida entonces por doxiciclina y lleva, en 5 días, a la conversión de los IPSC en progenitores MN. La posterior maduración, durante 7 días, conduce a poblaciones homogéneas de los MNs espinales o craneales. Nuestro método tiene varias ventajas sobre los protocolos anteriores: es extremadamente rápido y simplificado; no requiere infección viral o más aislamiento MN; permite generar diferentes subpoblaciones de MN (espinales y craneales) con un notable grado de maduración, como lo demuestra la capacidad de disparar trenes de potenciales de acción. Además, se puede obtener un gran número de neuronas motoras sin purificación de poblaciones mixtas. las neuronas motoras espinales y craneales derivadas de iPSC se pueden utilizar para el modelado in vitro de la esclerosis lateral amiotrófica y otras enfermedades neurodegenerativas de la neurona motora. Las poblaciones de neuronas motoras homogéneas pueden representar un recurso importante para la detección de fármacos específicos del tipo celular.
Introduction
La degeneración de la neurona motora (MN) desempeña un papel causal en las enfermedades humanas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la atrofia muscular espinal (SMA). El establecimiento de sistemas de modelos celulares in vitro adecuados que recapitulan la complejidad del MN humano es un paso importante hacia el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), que están dotadas de notables propiedades de diferenciación plurilinaje, se han derivado ahora de un número de pacientes afectados por las enfermedades de las neuronas motoras1,2. Las líneas adicionales de iPSC que transportan mutaciones patógenas asociadas a las enfermedades de MN han sido generadas por la edición génica, comenzando por el control “saludable” de las células madre pluripotentes3. Estas líneas representan herramientas útiles para el modelado de enfermedades in vitro y la detección de fármacos, siempre que estén disponibles los métodos apropiados para la diferenciación de iPSC en MNs. La razón detrás del desarrollo de este método es proporcionar a la comunidad científica interesada en las enfermedades del MN con un protocolo de diferenciación rápido y eficiente que da lugar a los MNs funcionales maduros. La primera ventaja de este método es su plazo de ejecución. Otro punto de fuerza relevante proviene de la eliminación de cualquier paso de purificación. Finalmente, el protocolo se puede utilizar para generar dos poblaciones distintas de neuronas motoras.
La posibilidad de generar diferentes subtipos de MNs es particularmente relevante para el modelado de enfermedades de manganeso. No todos los subtipos de MN son igualmente vulnerables en ELA y SMA y la aparición de síntomas en diferentes unidades de motor influye en gran medida en el pronóstico. En la ELA, el inicio de la columna vertebral con síntomas que comienzan en las extremidades superiores e inferiores conduce a la muerte en aproximadamente 3-5 años4. Por el contrario, el inicio bulbar, comenzando con la degeneración del MNs craneal, tiene un peor pronóstico. Por otra parte, el porcentaje de inicio bulbar es significativamente mayor en pacientes con mutaciones en las proteínas de unión al ARN FUS y TDP-43 que en individuos con mutaciones de SOD15. Casi la totalidad de los protocolos alternativos de diferenciación MN se basa en la actividad del ácido retinoico (RA), que confiere un carácter espinal a diferenciar iPSCs6,7,8. Esto limita la posibilidad de estudiar los factores intrínsecos, que podrían ser protectores en los subtipos específicos de MN9,10.
Consistente con un trabajo anterior en las células madre embrionarias de ratón11, hemos demostrado recientemente que en la expresión ectópico de iPSCs humanos de Ngn2, Isl1 y LHX3 (Nil) induce una identidad de MN espinal, mientras que Ngn2 y Isl1 más PHOX2A (NIP) especifican el mns craneal12. Por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo eficiente, que conduce a la producción de MNs humanos dotados de propiedades funcionales en un plazo de 12 días. El propósito de este método es obtener, en un corto período de tiempo y sin la necesidad de purificación (por ejemplo, por FACS), poblaciones celulares altamente enriquecidas para MNs con identidad espinal o craneal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo permite convertir eficientemente los IPSC humanos en neuronas motoras espinales y craneales gracias a la expresión ectópica de factores de transcripción específicos del linaje. Estos transgenes son inducibles por doxiciclina y se integran de forma estable en el genoma gracias a un vector basado en Transposon piggyBac. En una población mixta, una o varias copias del vector piggyBac se integrarán aleatoriamente en el genoma de las células individuales, aumentando el riesgo de alteraciones de la integr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer el servicio de imágenes del centro de vida nano Science, Istituto Italiano di tecnologia, para el apoyo y asesoramiento técnico. Estamos agradecidos a los miembros del centro para la vida Nano Ciencia para la discusión útil. Este trabajo fue apoyado parcialmente por una subvención de AriSLA (piloto Grant 2016 “StressFUS”) a AR.
Materials
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | chemicals for electrophysiological solutions |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Cell dissociation reagent |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003 |
| anti-goat Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848 |
| anti-mouse Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130 |
| anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117 |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Immunological Sciences | IS-20152-1 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Serum free supplement for neuronal cell maintenance |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Brain-Derived Neurotrophic Factor |
| Blasticidin | Sigma-Aldrich | 203350 | Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Clampex 10 software | Molecular Devices | Clampex 10 | Membrane currents recording system |
| Corning Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports |
| CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA | Biological Industries | 05-710-1E | Freezing medium for human iPSCs |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5146 | chemicals for electrophysiological solutions |
| DAPI powder | Roche | 10236276001 | 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Gamma secretase inhibitor |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Basal medium for cell culture |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Commercial human iPSC line |
| E.Z.N.A Total RNA Kit | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Glial-Derived Neurotrophic Factor |
| Gibco Episomal hiPSC Line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Commercial human iPSC line |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health. |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | chemicals for electrophysiological solutions |
| iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | Kit for gene expression analysis using real-time qPCR |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument |
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | chemicals for electrophysiological solutions |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | chemicals for electrophysiological solutions |
| L-ascorbic acid | LKT Laboratories | A7210 | Used in cell culture as an antioxidant |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | iX83 FluoView1200 | Confocal microscope for acquisition of immunostaining images |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | chemicals for electrophysiological solutions |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Mounting Medium | Ibidi | 50001 | Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays |
| Multiclamp patch-clamp amplifier | Molecular Devices | 700B | Membrane currents recording system |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability. |
| Neon 100 μL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Cell electroporation kit |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Cell electroporation system |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer |
| NutriStem-XF/FF | Biological Industries | 05-100-1A | Human iPSC culture medium |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | Used for cell fixation in immunostaining assays |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium |
| PBS Ca2+/Mg2+ free | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria. |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays |
| Upright microscope | Olympus | BX51VI | Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival |
| μ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Support for high–end microscopic analysis of fixed cells |
References
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