Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü
Summary
Bu protokol indüklenebilir piggyBac vektörler transkripsiyon faktörlerin ektopik ifade, bir spinal veya kranial kimlik ile motor nöronlar içine indüklenen pluripotent kök hücrelerinin hızlı ve verimli dönüşüm sağlar.
Abstract
Burada insan indüklenen pluripotent kök hücrelerden fonksiyonel omurilik ve kraniyal motor nöronları elde etmek için bir yöntem tarif (ıpscs). Motor nöron içine doğrudan dönüşüm transkripsiyon faktörleri alternatif modüller ektopik ifade ile elde edilir, yani Ngn2, Isl1 ve Lhx3 (NIL) veya Ngn2, Isl1 ve Phox2a (NSIP). NIL ve NıP sırasıyla spinal ve kraniyal motor nöron kimliğini belirtir. Protokollerimiz, NIP ‘nin bir piggybac transpozon vektörü ile genomda stabil entegre edildiği değiştirilmiş IPSC hatları ile başlar. Transgenlerin ifadesi daha sonra doksisiklin ve yol açar, 5 gün içinde, ıpscs MN progenitors dönüşümüne. Sonraki olgunlaşma, 7 gün boyunca, spinal veya kranial MNs homojen nüfusa yol açar. Bizim yöntemi önceki protokoller üzerinde çeşitli avantajları tutar: son derece hızlı ve Basitleştirilmiş; viral enfeksiyon veya daha fazla MN yalıtım gerektirmez; farklı MN alt kitleleri (omurilik ve kranial) olgunlaşma dikkat çekici bir derece ile Üreten sağlar, eylem potansiyelleri trenler yangın yeteneği tarafından gösterilmiştir. Dahası, çok sayıda motor nöronları karışık nüfus arıtmadan elde edilebilir. IPSC-türev spinal ve kraniyal motor nöronlar Amilotrofik lateral skleroz ve motor nöron diğer nörodejeneratif hastalıkların in vitro modelleme için kullanılabilir. Homojen motor nöron nüfus hücre tipi spesifik ilaç gösterimleri için önemli bir kaynak temsil edebilir.
Introduction
Motor nöron (MN) dejenerasyonu amilotrofik lateral skleroz (ALS) ve spinal kas atrofi (SMA) gibi insan hastalıklarında etken rol oynar. İnsan MN karmaşıklığı özetlemek uygun in vitro hücre modeli sistemleri kurulması yeni terapötik yaklaşımlar gelişimine yönelik önemli bir adımdır. Belirgin plurilineage farklılaşma özellikleri ile donatılmış olan indüklenen pluripotent kök hücreleri (ıpscs), şimdi motor nöron hastalıkları etkilenen hastaların bir dizi türetilmiştir1,2. MN hastalıklarına ilişkili patojen mutasyonları taşıyan ek IPSC hatları, kontrol “sağlıklı” pluripotent kök hücreleri3‘ ten başlayarak gen düzenleme ile üretilir. Bu çizgiler in vitro hastalık modelleme ve ilaç taraması için yararlı araçları temsil eder, MNs içine IPSC farklılaşma için uygun yöntemler mevcuttur sağlanır. Bu yöntemin gelişiminin arkasındaki mantık, MN hastalıklarıyla ilgilenen bilimsel toplumu, Olgun fonksiyonel MNs ‘ye yol veren hızlı ve verimli bir farklılaşma protokolüyle sağlamaktayız. Bu yöntemin ilk avantajı, yürütme zaman dilimi olur. Güç başka bir ilgili noktası herhangi bir arıtma adım eliminasyon gelir. Son olarak, protokol motor nöronların iki farklı nüfus oluşturmak için kullanılabilir.
MNs farklı alt türleri oluşturma olasılığı MN hastalıkları modelleme için özellikle ilgilidir. Tüm MN alt türleri ALS ve SMA ‘da eşit derecede savunmasız değildir ve farklı motor ünitelerinde semptomların başlangıcı prognozu büyük ölçüde etkiler. ALS ‘de, üst ve alt ekstremitelerde başlayan semptomlarla spinal başlangıçlar yaklaşık 3-5 yıl içinde ölüme yol açar4. Tersine, kraniyal MNS dejenerasyonu ile başlayan bulber başlangıcı, en kötü prognoz vardır. Dahası, RNA-bağlayıcı proteinleri FUS ve TDP-43 mutasyonları olan hastalarda SOD1 mutasyonları5olan bireylere göre, bulber başlangıcı yüzdesi önemli ölçüde daha yüksektir. Alternatif MN farklılaşma protokollerinin neredeyse bütünlüğü, ipscs6,7,8türevlerini ayırt etmek için omurilik karakterini gösteren retinoik asit (ra) aktivitesine dayanır. Bu spesifik MN alt türlerinden9,10koruyucu olabilir içsel faktörler, eğitim olasılığını sınırlar.
Fare embriyonik kök hücrelerinde bir önceki çalışma ile tutarlı11, son zamanlarda ınsan ıpscs ektopik ifade Ngn2, Isl1 ve LHX3 (NIL) BIR spinal MN kimlik indükler göstermiştir, Ngn2 ve Isl1 artı Phox2a (n) kranial MNS12belirtin. Bu nedenle, 12 gün boyunca işlevsel özelliklere sahip insan MNs üretimini sağlayan etkili bir protokol geliştirdik. Bu yöntemin amacı, kısa bir zaman diliminde ve arıtma (örneğin, FACS) gerek kalmadan elde etmektir, hücre nüfusu yüksek spinal veya kranial kimlik ile MNs için zenginleştirilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, insan ıpscs ‘yi, kemiğe özel transkripsiyon faktörlerinin ektopik ifadesi sayesinde Spinal ve kranial motor nöronlara verimli bir şekilde dönüştürmeyi sağlar. Bu transgenler, doksisiklin ile indüklenebilir ve piggyBac transposon tabanlı vektörü sayesinde genomda stabil bir şekilde entegre edilir. Karma bir nüfusa göre, piggyBac vektörünün bir veya birkaç kopyası, tek hücrelerin genomuna rasgele entegre edilecek ve genom bütünlüğü değişimi riskini arttırır. Dahası, iPSC subkl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, destek ve teknik tavsiyeler için Life nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia Center ‘da Imaging tesisine teşekkür etmek istiyor. Biz yararlı tartışma için yaşam nano bilim merkezi üyelerine minnettarız. Bu çalışmanın kısmen AriSLA (pilot Grant 2016 “StressFUS”) dan AR için bir hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | chemicals for electrophysiological solutions |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Cell dissociation reagent |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003 |
| anti-goat Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848 |
| anti-mouse Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130 |
| anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117 |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Immunological Sciences | IS-20152-1 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Serum free supplement for neuronal cell maintenance |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Brain-Derived Neurotrophic Factor |
| Blasticidin | Sigma-Aldrich | 203350 | Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Clampex 10 software | Molecular Devices | Clampex 10 | Membrane currents recording system |
| Corning Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports |
| CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA | Biological Industries | 05-710-1E | Freezing medium for human iPSCs |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5146 | chemicals for electrophysiological solutions |
| DAPI powder | Roche | 10236276001 | 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Gamma secretase inhibitor |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Basal medium for cell culture |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Commercial human iPSC line |
| E.Z.N.A Total RNA Kit | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Glial-Derived Neurotrophic Factor |
| Gibco Episomal hiPSC Line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Commercial human iPSC line |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health. |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | chemicals for electrophysiological solutions |
| iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | Kit for gene expression analysis using real-time qPCR |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument |
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | chemicals for electrophysiological solutions |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | chemicals for electrophysiological solutions |
| L-ascorbic acid | LKT Laboratories | A7210 | Used in cell culture as an antioxidant |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | iX83 FluoView1200 | Confocal microscope for acquisition of immunostaining images |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | chemicals for electrophysiological solutions |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Mounting Medium | Ibidi | 50001 | Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays |
| Multiclamp patch-clamp amplifier | Molecular Devices | 700B | Membrane currents recording system |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability. |
| Neon 100 μL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Cell electroporation kit |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Cell electroporation system |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer |
| NutriStem-XF/FF | Biological Industries | 05-100-1A | Human iPSC culture medium |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | Used for cell fixation in immunostaining assays |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium |
| PBS Ca2+/Mg2+ free | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria. |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays |
| Upright microscope | Olympus | BX51VI | Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival |
| μ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Support for high–end microscopic analysis of fixed cells |
References
- Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
- Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
- Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
- Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
- Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
- Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
- Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
- Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960 (2016).
- Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
- De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
- Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
- Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
- Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
- Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
- Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
- Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).
