PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환
Summary
이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포를 유도성 piggyBac 벡터에서 전사 인자의 발현에 의해 척추 또는 두개골 정체성을 가진 모터 뉴런으로 신속 하 고 효율적으로 전환 할 수 있습니다.
Abstract
우리는 여기에서 인간 유도 만능 줄기 세포 로부터 기능적 척추 및 두개골 운동 뉴런을 얻는 방법을 설명 한다 (iPSCs). 운동 뉴런으로의 직접 전환은 전사 인자의 대체 모듈, 즉 Ngn2, Isl1 및 Lhx3 (NIL) 또는 Ngn2, Isl1 및 Phox2a (닙)의 자 궁 외 발현에 의해 얻어진 다. NIL과 닙은 각각 척추와 두개골 운동 신경 정체성을 지정 합니다. 우리의 프로토콜은 NIL 또는 닙이 piggyBac 전치 벡터를 통해 게놈에 안정적으로 통합 되는 수정 된 iPSC 라인의 생성으로 시작 합니다. 트랜스 유전자의 발현은 이어서 독 시 사이 클린에 의해 유도 되 고, 5 일 후에, iPSCs를 MN 조상로 전환 한다. 이후 성숙, 7 일 동안, 척추 또는 두개골 MNs의 동종 인구에 이르게. 우리의 방법은 이전 프로토콜에 비해 몇 가지 장점을 보유: 그것은 매우 신속 하 고 단순화; 그것은 바이러스 감염이 나 추가 MN 격리를 필요로 하지 않습니다; 그것은 활동 전위의 기차를 발사 하는 능력에 의해 입증 된 대로, 성숙의 놀라운 학위와 다른 MN 하위 인구 (척추와 두개골)를 생성 할 수 있습니다. 더욱이, 다 수의 모터 뉴런은 혼합 된 집단 으로부터 정제 없이 얻어질 수 있다. iPSC 유래 척추 및 두개골 모터 뉴런은 운동 신경의 근 위축 성 측 삭 경화 증 및 기타 신경 변성 질환의 시험관 내 모델링에 사용 될 수 있다. 균질 한 운동 뉴런 집단은 세포 형 특정 약물 스크리닝을 위한 중요 한 자원을 나타낼 수 있다.
Introduction
운동 뉴런 (MN) 변성은 근 위축 성 측 삭 경화 증 (ALS)과 척추 근육 위축 (SMA)과 같은 인간의 질병에서 원인 역할을 한다. 인간 MN의 복잡성을 탈환 하는 적절 한 시험관 내 셀 모델 시스템을 확립 하는 것은 새로운 치료 접근법의 개발을 향한 중요 한 단계 이다. 유도 만능 줄기 세포 (ipscs)는 주목할 만한 복수형 다이 신 분화 특성을 부여 받고 있으며, 이제는 운동 신경 질환1,2에 의해 영향을 받는 많은 환자 로부터 유래 되었다. MN 질환에 관련 된 병원 성 돌연변이를 운반 하는 추가 iPSC 라인은 제어 “건강 한” 만능 줄기 세포 로부터 시작 하 여 유전자 편집에 의해 생성 되었다3. 이들 라인은 MNs로의 iPSC 분화를 위한 적절 한 방법이 제공 되는 경우 시험관 내 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 유용한 도구를 나타낸다. 이 방법의 개발 뒤에 이론적 근거는 성숙한 기능적인 MNs를 초래 하는 빠르고 능률적인 분화 프로토콜을 가진 MN 질병에 관심 있는 과학적인 공동체를 제공 하기 위한 것입니다. 이 방법의 첫 번째 이점은 실행 시간입니다. 또 다른 강도의 포인트는 정제 단계의 제거에서 온다. 마지막으로, 프로토콜은 모터 뉴런의 두 개의 별개의 인구를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.
MNs의 다른 특수형을 생성 하는 가능성은 MN 질병의 모형 화를 위해 특히 관련 됩니다. 모든 MN 특수형은 ALS와 SMA에서 동등 하 게 취약 하 그리고 다른 모터 단위에 있는 현상의 개시는 크게 예 후에 영향을 미칩니다. ALS에서, 상부 및 하 부 사지에서 시작 하는 현상에 척추 발병은 약 3-5 년에서 죽음으로 이끌어 냅니다4. 반대로, 두개골 MNs의 변성으로 시작 하는 불 바 발병은 최악의 예 후를가지고 있습니다. 더욱이, 불 바 발병의 비율은 RNA 결합 단백질 인 스와 TDP-43의 돌연변이 환자에서 SOD1 돌연변이를 가진 개인 보다 현저히 높다5. 대체 MN 분화 프로토콜의 총합은 레 틴 산 (RA)의 활동에 의존 하 여 ipscs6,7,8을 차별화 하는 척추 문자를 부여 합니다. 이것은 특정 MN 특수형9,10에서 방어적 일 수 있던 본질적인 요인 연구의 가능성을 제한 합니다.
마우스 배아 줄기 세포 (11)의 이전 작업과 일치 하 여, 우리는 최근에 인간 Ipscs에서 Ngn2, Isl1 및 LHX3 (전무)의 발현이 척추 MN 동일성을 유도 하는 반면 Ngn2 및 Isl1 플러스 PHOX2A (닙)는 두개골 MNs (12)를 지정 하는 것으로 나타났다. 우리는 따라서 효율적인 프로토콜을 개발 하 여 12 일의 턴 어 라운드에서 기능적 특성을 부여 하는 인간 MNs의 생산으로 이끌어 냅니다. 이 방법의 목적은 정제 (예를 들어, FACS)에 대 한 필요 없이 짧은 시간 프레임에서, 척추 또는 두개골 동일성을 가진 MNs에 대해 고도로 농축 된 세포 집단을 구하는 것 이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 효율적으로 인간 ipscs를 척추 및 두개골 운동 뉴런으로 변환 하 여 계보 관련 특정 전사 인자의 자 궁 외 발현을 가능 하 게 합니다. 이들 트랜스 유전자는 독 시 사이 클린에 의해 유도성 되 고, piggyBac 전치 자 기반 벡터 덕분에 게놈에 안정적으로 통합 된다. 혼합 된 집단에서, piggyBac 벡터의 하나 또는 여러 사본은 개별 세포의 게놈에 무작위로 통합 될 것이 고, 게놈 완전성 변경의 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 생명의 나노 과학 센터에서 이미징 시설에 감사 하 고 싶습니다.,이 스 티토 하세가와 디 Tecnologia, 지원 및 기술 조언을. 우리는 생명 나노 과학 센터의 회원 들에 게 도움이 되는 토론에 감사 드립니다. 이 작품은 AriSLA (파일럿 그랜트 2016 “StressFUS”)의 보조금에 의해 부분적으로 AR에 지원 되었다.
Materials
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | chemicals for electrophysiological solutions |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Cell dissociation reagent |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003 |
| anti-goat Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848 |
| anti-mouse Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130 |
| anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117 |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Immunological Sciences | IS-20152-1 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Serum free supplement for neuronal cell maintenance |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Brain-Derived Neurotrophic Factor |
| Blasticidin | Sigma-Aldrich | 203350 | Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Clampex 10 software | Molecular Devices | Clampex 10 | Membrane currents recording system |
| Corning Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports |
| CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA | Biological Industries | 05-710-1E | Freezing medium for human iPSCs |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5146 | chemicals for electrophysiological solutions |
| DAPI powder | Roche | 10236276001 | 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Gamma secretase inhibitor |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Basal medium for cell culture |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Commercial human iPSC line |
| E.Z.N.A Total RNA Kit | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Glial-Derived Neurotrophic Factor |
| Gibco Episomal hiPSC Line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Commercial human iPSC line |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health. |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | chemicals for electrophysiological solutions |
| iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | Kit for gene expression analysis using real-time qPCR |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument |
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | chemicals for electrophysiological solutions |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | chemicals for electrophysiological solutions |
| L-ascorbic acid | LKT Laboratories | A7210 | Used in cell culture as an antioxidant |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | iX83 FluoView1200 | Confocal microscope for acquisition of immunostaining images |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | chemicals for electrophysiological solutions |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Mounting Medium | Ibidi | 50001 | Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays |
| Multiclamp patch-clamp amplifier | Molecular Devices | 700B | Membrane currents recording system |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability. |
| Neon 100 μL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Cell electroporation kit |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Cell electroporation system |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer |
| NutriStem-XF/FF | Biological Industries | 05-100-1A | Human iPSC culture medium |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | Used for cell fixation in immunostaining assays |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium |
| PBS Ca2+/Mg2+ free | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria. |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays |
| Upright microscope | Olympus | BX51VI | Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival |
| μ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Support for high–end microscopic analysis of fixed cells |
References
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