In vivivo Inibizione del MicroRNA per diminuire la crescita tumorale nei topi
Summary
Questo protocollo descrive i modelli murini xenoinpito e ortotopici della tumorigenesi tiroidea umana come piattaforma per testare i trattamenti inibitori basati su microRNA. Questo approccio è ideale per studiare la funzione degli RNA non codificanti e il loro potenziale come nuovi obiettivi terapeutici.
Abstract
I microRNA (miRNA) sono importanti regolatori dell’espressione genica attraverso la loro capacità di destabilizzare l’mRNA e inibire la traduzione degli mRNA bersaglio. Un numero sempre crescente di studi ha identificato i miRNA come potenziali biomarcatori per la diagnosi e la prognosi del cancro, nonché come obiettivi terapeutici, aggiungendo una dimensione aggiuntiva alla valutazione e al trattamento del cancro. Nel contesto del cancro della tiroide, la tumorigenesi deriva non solo da mutazioni in geni importanti, ma anche dalla sovraespressione di molti miRNA. Di conseguenza, il ruolo dei miRNA nel controllo dell’espressione genica della tiroide si sta evolvendo come un importante meccanismo nel cancro. Qui, presentiamo un protocollo per esaminare gli effetti della somministrazione di miRNA-inibitori come modalità terapeutica nel cancro della tiroide utilizzando modelli di xenotrapianto del tumore umano e modelli murini ortotopici. Dopo aver engineering cellule tumorali della tiroide stabili che esprimono GFP e luciferasi, le cellule vengono iniettate nei topi nudi per sviluppare tumori, che possono essere seguiti da bioluminescenza. L’inibizione in vivo di un miRNA può ridurre la crescita del tumore e upregulate bersagli genici genici del miRNA. Questo metodo può essere utilizzato per valutare l’importanza di un miRNA determinato in vivo, oltre a identificare nuovi bersagli terapeutici.
Introduction
Il cancro della tiroide è una malignità endocrina con un’incidenza crescente, anche se in termini generali ha un buon risultato1. Tuttavia, alcuni pazienti sviluppano forme aggressive della malattia che non sono curabili e le basi molecolari sono poco comprese2.
I miRNA sono RNA non codificanti lunghi 22 nucleotidi che regolano l’espressione genica in molti tessuti, in genere legandosi di coppie di base alla regione non traslazionale 3′ (3’UTR) di RNA messaggeri bersaglio (mRNA), innescando la degradazione dell’mRNA o la repressione traslazionale 3 (COM del nome , 4. Ci sono sempre più prove che dimostrano che la deregolazione dell’espressione del microRNA è un segno distintivo del cancro, in quanto queste molecole modulano la segnalazione proliferale, la migrazione, l’invasione e la metastasi, e possono fornire resistenza all’apoptosi 5,6. Negli ultimi anni, molti studi hanno identificato i miRNA come potenziali biomarcatori perla diagnosi e la prognosi del cancro, nonché obiettivi terapeutici 7, fornendo una nuova dimensione alla valutazione e al trattamento del cancro.
I miRNA hanno preso il centro dell’oncologia molecolare umana come fattori chiave dei neoplasmi tiroidei umani8,9,10,11,12. Tra i miRNA up-regolato, miR-146b è altamente sovraespresso nei tumori Papillary Thyroid Carcinoma (PTC) e ha dimostrato di aumentare significativamente la proliferazione cellulare, e di essere associato con aggressività e prognosi triste6, 12 mila , 13 del sistema , 14 Del sistema , 15. Inoltre, miR-146b regola diversi geni tiroidei coinvolti nella differenziazione12e anche importanti geni soppressori tumorali come PTEN16 e DICER117. Nonostante la loro importanza nella biologia del cancro, la terapia del cancro basata su miRNA è ancora nelle sue fasi iniziali, e pochissimi studi hanno affrontato il cancro della tiroide – il più frequente dei tumori endocrini18. Qui descriviamo un protocollo usando due diversi modelli murini con tumori di origine umana, in cui la somministrazione di un inibitore di miRNA sintetico (antagomiR) che inibisce specificamente un miRNA cellulare può bloccare la crescita del tumore. Per la prima volta abbiamo usato un modello comune di xenotrapianto, e la somministrazione intratumorale locale di un antagomiR ha diminuito la crescita tumorale misurata come riduzione della bioluminescenza tumorale16. Poiché la creazione di robusti modelli murini che imitano la progressione del tumore umano è essenziale per sviluppare approcci terapeutici unici, l’impianto ortotopico dei tumori umani primari è una piattaforma più preziosa per la convalida clinica di nuovi farmaci modelli di impianto sottocutaneo. Così, al fine di valutare meglio il potenziale terapeutico dell’antagomir, abbiamo usato un modello di topo ortotopico con consegna sistemica nel flusso sanguigno, ottenendo gli stessi risultati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento descrive un metodo per studiare la funzione in vivo di un miRNA al fine di comprendere meglio il suo ruolo nell’avvio e nella progressione del tumore, e il suo potenziale come bersaglio terapeutico nel cancro della tiroide. I modelli di xenotrapianto tumorale qui descritti si basano sull’uso di cellule che possono essere monitorate dal loro segnale di bioluminescenza, permettendo la misurazione della crescita del tumore in vivo sotto l’influenza di un trattamento. Inoltre, descriviamo l’uso di un trattam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Raquel Arocha Riesco per la sua assistenza con il trattamento e la cura dei topi. Ringraziamo il Dr. J. Blanco (Catalonian Institute for Advance Chemistry-CSIC) e il Dr. E. Mato (Institut de Reserca de l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barcellona (Spagna) per aver donato rispettivamente le cellule CMV-Firefly luc- IRES-EGFP e Cal62-Luc.
Materials
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
References
- Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
- Landa, I., et al. Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 1052-1066 (2016).
- Gregory, R. I., Shiekhattar, R. MicroRNA biogenesis and cancer. 암 연구학. 65 (9), 3509-3512 (2005).
- Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
- Hammond, S. M. MicroRNAs as oncogenes. Current Opinion In Genetics & Development. 16 (1), 4-9 (2006).
- Cancer Genome Atlas Reserch Network. Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma. Cell. 159 (3), 676-690 (2014).
- Li, Z., Rana, T. M. Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (8), 622-638 (2014).
- Pallante, P., Battista, S., Pierantoni, G. M., Fusco, A. Deregulation of microRNA expression in thyroid neoplasias. Nature Reviews. Endocrinology. 10 (2), 88-101 (2014).
- Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNAs in thyroid development, function and tumorigenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 456, 44-50 (2017).
- Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNA Deregulation in Anaplastic Thyroid Cancer Biology. International Journal of Endocrinology. 2014, 743450 (2014).
- Riesco-Eizaguirre, G., Santisteban, P. Endocrine Tumours: Advances in the molecular pathogenesis of thyroid cancer: lessons from the cancer genome. European Journal of Endocrinology. 175 (5), R203-R217 (2016).
- Riesco-Eizaguirre, G., et al. The miR-146b-3p/PAX8/NIS Regulatory Circuit Modulates the Differentiation Phenotype and Function of Thyroid Cells during Carcinogenesis. 암 연구학. 75 (19), 4119-4130 (2015).
- Lima, C. R., Geraldo, M. V., Fuziwara, C. S., Kimura, E. T., Santos, M. F. MiRNA-146b-5p upregulates migration and invasion of different Papillary Thyroid Carcinoma cells. BMC Cancer. 16, 108 (2016).
- Lee, J. C., et al. MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer. Cancer. 119 (24), 4358-4365 (2013).
- Deng, X., et al. MiR-146b-5p promotes metastasis and induces epithelial-mesenchymal transition in thyroid cancer by targeting ZNRF3. Cellular Physiology and Biochemistry. International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 35 (1), 71-82 (2015).
- Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Santisteban, P. MicroRNA-146b promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and thyroid cancer progression by targeting PTEN. Oncogene. , (2018).
- Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness. Oncogene. , (2019).
- Xing, M. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).
