Identification des facteurs nucléoleux pendant la réplication du VIH-1 par l'immunoprécipitation rev et la spectrométrie de masse

Summary

Ici nous décrivons Rev immunoprécipitation en présence de la réplication de HIV-1 pour la spectrométrie de masse. Les méthodes décrites peuvent être utilisées pour l’identification des facteurs nucléolaire impliqués dans le cycle infectieux du VIH-1 et s’appliquent à d’autres modèles de maladies pour la caractérisation des voies sous-étudiées.

Abstract

Le cycle infectieux du VIH-1 nécessite des interactions entre protéines virales et les facteurs hôtes pour faciliter la réplication, l’emballage et la libération virales. Le cycle infectieux nécessite en outre la formation de complexes protéiques viraux/hôtes avec l’ARN VIH-1 pour réguler l’épissage et permettre le transport nucléocytoplasmique. La protéine HIV-1 Rev accomplit l’exportation nucléaire des ARNm VIH-1 par la multimerisation avec des cibles introniques cis-action – l’élément de réponse Rev (RRE). Un signal de localisation nucléoliste (NoLS) existe dans le coOH-terminus du motif Rev arginine-riche (ARM), permettant l’accumulation de complexes Rev/RRE dans le nucléole. Les facteurs nucléolaux sont spéculés pour soutenir le cycle infectieux du VIH-1 par le biais de diverses autres fonctions en plus de la médiation de l’exportation nucléaire indépendante de l’ARNm et de l’épissage. Nous décrivons une méthode d’immunoprécipitation de type sauvage (WT) Rev par rapport aux mutations nucléoliennes de Rev (suppression et mutations de Rev-NoLS à point unique) en présence de la réplication de HIV-1 pour la spectrométrie de masse. Les facteurs nucléolaux impliqués dans le transport nucléocytoplasmique (nucléophosmin B23 et nucléoline C23), ainsi que les facteurs d’épissage cellulaire, perdent l’interaction avec Rev en présence de mutations Rev-NoLS. Divers autres facteurs nucléolaire, tels que la boîte C/D 58 du snoARN, sont identifiés pour perdre l’interaction avec les mutations Rev, mais leur fonction dans le cycle de réplication DU VIH-1 reste inconnue. Les résultats présentés ici démontrent l’utilisation de cette approche pour l’identification des facteurs nucléolaire viraux/hôtes qui maintiennent le cycle infectieux du VIH-1. Les concepts utilisés dans cette approche s’appliquent à d’autres modèles viraux et de maladies nécessitant la caractérisation de voies sous-étudiées.

Introduction

Le nucléole est postulé comme le terrain d’interaction de divers facteurs cellulaires et viraux nécessaires à la réplication virale. Le nucléolus est une structure complexe subdivisée en trois compartiments différents : le compartiment fibrillaire, le compartiment fibrillaire dense et le compartiment granulaire. La protéine HIV-1 Rev se localise spécifiquement dans les compartiments granulaires; cependant, la raison de ce modèle de localisation est inconnue. En présence de mutations à un seul point dans la séquence NoLS (Rev mutations 4, 5 et 6), Rev maintient un modèle nucléolif et a déjà été montré pour sauver la réplication VIH-1_HXB2, cependant, avec une efficacité réduite par rapport à WT Rev¹ . Toutes les mutations à un seul point sont incapables de soutenir le cycle infectieux VIH-1_NL4-3. En présence de multiples mutations à un seul point dans la séquence NoLS (mutations Rev-NoLS 2 et 9), Rev a été observé pour se disperser dans le noyau et le cytoplasme et n’a pas été en mesure de sauver la réplication VIH-1_HXB2 ¹. Le but de cette étude protéomique est de déchiffrer les facteurs cellulaires nucléolaux ainsi que non nucléolaux impliqués dans la voie infectieuse du VIH-1 médiée par le révérend. Les conditions d’immunoprécipitation de Rev sont optimisées par l’interaction avec la phosphoprotéine nucléolar B23, qui a été précédemment montrée pour perdre l’interaction avec Rev en présence des mutations nucléolaures.

Les facteurs cellulaires rev ont été largement étudiés dans le passé; cependant, ceci a été fait en l’absence de pathogénie virale. Une protéine, en particulier, qui est caractérisée dans cette étude par l’interaction Rev pendant la réplication du VIH-1 est la phosphoprotéine nucléolée B23 – également appelé nucléophosme (NPM), numatrine, ou NO38 chez les amphibiens^{2,3, 4}. B23 est exprimé en trois isoformes (NPM1, NPM2, et NPM3) – tous les membres de la nucléophosmine/nucléoplasmin famille de chaperon nucléaire^5,6. Le chaperon moléculaire NPM1 fonctionne dans l’assemblage approprié des nucléosomes, dans la formation de complexes protéiques/acides nucléiques impliqués dans les structures de chromatine d’ordre supérieur^7,8, et dans la prévention de l’agrégation et dépliement des protéines cibles à travers un domaine central N-terminal (résidus 1-120)⁹. La fonctionnalité NPM1 s’étend à la genèse ribosome par le transport des particules préribosomal entre le noyau et le cytoplasme^10,11, le traitement de l’ARN préribosomal dans la séquence ^{d’espacer transcrit interne 12,13}, et l’arrestation de l’agrégation nucléolaires de protéines au cours de l’assemblage ribosomal^14,15. NPM1 est impliqué dans l’inhibition de l’apoptose¹⁶ et dans la stabilisation des suppresseurs de tumeur ARF^17,18 et p53¹⁹, révélant son double rôle en tant que facteur oncogène et suppresseur de tumeur. NPM1 participe aux activités cellulaires de stabilité du génome, de réplication centrosome et de transcription. NPM1 se trouve dans les nucléoli pendant l’interphase de cycle cellulaire, le long de la périphérie chromosomique pendant la mitose, et dans les corps prenucléolaire (PNB) à la conclusion de la mitose. NPM2 et NPM3 ne sont pas aussi bien étudiés que NPM1, qui subit des niveaux d’expression altérés pendant la malignité²⁰.

NPM1 est documenté dans l’étanchage nucléocytoplasmique de diverses protéines nucléaires/nucléolées par le biais d’un NES interne et NLS^9,21 et a été précédemment signalé pour conduire l’importation nucléaire de HIV-1 Tat et Rev protéines. En présence de protéines de fusion B23-domaine-galactosidase, Tat se localise mal dans le cytoplasme et perd son activité de transactivation; cela démontre une forte affinité de Tat pour B23². Une autre étude a établi un complexe stable Rev/B23 en l’absence de RNAR contenant du RRE. En présence de l’ARNm RRE, Rev se dissocie de B23 et se lie de préférence à la RRE VIH, conduisant au déplacement de B23²². On ne sait pas où, au niveau subnucléaire, la transactivation de Tat et le processus d’échange de Rev de B23 pour l’ARNm VIH ont lieu. Les deux protéines sont postulées pour entrer dans le nucléole simultanément par l’interaction B23. On s’attend à ce que d’autres protéines cellulaires d’hôte se chez les personnes vivant dans la voie nucléolif du VIH. Les méthodes décrites dans cette enquête protéomique aideront à élucider l’interaction du nucléole avec les facteurs cellulaires d’hôte impliqués pendant la pathogénie de HIV-1.

L’enquête sur la protéomique a été lancée par l’expression de mutations à un seul point du Rev NoLS (M4, M5 et M6) et de multiples substitutions d’arginine (M2 et M9) pour la production de VIH-1_HXB2. Dans ce modèle, une lignée cellulaire HeLa exprimant de façon stable le VIH-1_HXB2 (HLfB) est transfectée avec des mutations nucléolaires WT Rev et Rev contenant une étiquette de drapeau à l’extrémité 3′ La présence de WT Rev permettra à la réplication virale de se produire dans la culture HLfB, par rapport aux mutations Rev-NoLS qui ne sauvent pas l’insuffisance Rev (M2 et M9), ou permettent la réplication virale de se produire, mais pas aussi efficacement que WT Rev (M4, M5, et M6)¹. Le lysate cellulaire est recueilli 48 h plus tard après la prolifération virale en présence de l’expression Rev et soumis à l’immunoprécipitation avec un tampon de lyse optimisé pour l’interaction Rev/B23. L’optimisation de la mémoire tampon de Lyse à l’aide de concentrations variables de sel est décrite, et les méthodes d’élution des protéines pour le VIH-1 Rev sont comparées et analysées dans des gels SDS-PAGE tachés d’argent ou de Coomassie. La première approche protéomique implique l’analyse directe d’un échantillon élucidé de WT Rev, M2, M6 et M9 exprimés par spectrométrie de masse en tandem. Une deuxième approche par laquelle les eluates de WT Rev, M4, M5, et M6 ont subi un processus d’extraction de gel est comparée à la première approche. L’affinité peptide aux mutations de Rev-NoLS par rapport à WT Rev est analysée et la probabilité d’identification de protéine affichée. Ces approches révèlent des facteurs potentiels (nucléolaure et nonnucléolaure) qui participent au transport et à l’épissage de l’ARNm 1 du VIH-1 avec Rev pendant la réplication du VIH-1. Dans l’ensemble, les conditions de lyse cellulaire, de propriété intellectuelle et d’élution décrites s’appliquent aux protéines virales d’intérêt pour la compréhension des facteurs cellulaires de l’hôte qui activent et régulent les voies infectieuses. Ceci est également applicable à l’étude des facteurs d’hôte cellulaire requis pour la persistance de divers modèles de maladie. Dans ce modèle de protéomique, HIV-1 Rev IP est optimisé pour l’interaction B23 pour élucider les facteurs nucléolaux impliqués dans l’activité de fermeture nucléocytoplasmique et la liaison de l’ARNm VIH-1. En outre, des lignées cellulaires exprimant de façon stable des modèles de maladies infectieuses déficientes pour les protéines clés d’intérêt peuvent être développées, semblables à la lignée cellulaire HLfB, pour étudier les voies infectieuses d’intérêt.

Protocol

1. Culture cellulaire Maintenir le HLfB dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10% de sérum bovin foetal (FBS), 2 mM L-glutamine, et 1 mM de pyruvate de sodium dans les plaques de 100 mm traitées par la culture tissulaire. Maintenir les cultures cellulaires à 37 oC dansun incubateur humidifié fourni avec 5 % de CO 2. Passer les cellules confluentes à une densité cellulaire de 1 x 106 cellules/mL. Jetez le média de culture cellulaire. Rincer déli…

Representative Results

Rev-NoLS single- et multiple-point mutations arginine, correspondant à une variété de modèles de localisation subcellulaire, ont été examinés dans leur capacité à interagir avec les facteurs de l’hôte cellulaire par rapport à WT Rev. WT Rev-3’flag et pcDNA-flag vecteur ont été exprimés dans la culture HLfB. Des complexes de protéine ont été traités du lysate total de cellules et souillés avec le réactif argenté de tache. Rev-NoLS-3’flag est détectable (environ 18 kDa) dans trois conditions …

Discussion

Des analyses spectrométriques de masse comparant les mutations Rev-NoLS et WT Rev en présence du VIH-1 ont été évaluées pour comprendre les facteurs nucléolaux impliqués dans le cycle de réplication virale. Ceci identifierait les composants nucléolaux requis pour l’infectiosité virale. Le nucléolar B23 a une forte affinité avec Rev-NoLS et fonctionne dans la localisation nucléolif du Rev³ et le transport nucléocytoplasmique des ARNM du VIH 22 . L’affinité du…

Materials

Acetic acid	Fisher Chemical	A38S-212
Acetonitrile	Fisher Chemical	A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide	BioRad	1610158
Ammonium bicarbonate	Fisher Chemical	A643-500
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel	Sigma-Aldrich	A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG	Sigma-Aldrich	F3165
BioMax MS film	Carestream	8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL	Bio-Rad	5000006
B23 mouse monoclonal IgG	Santa Cruz Biotechnologies	sc-47725
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126
Carnation non-fat powdered milk	Nestle	N/A
Cell scraper	ThermoFisher Scientific	179693PK
C18IonKey nanoTile column	Waters	186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes	Fisher Scientific	08-772-22
Dithiothreitol	Thermo Scientific	J1539714
1 x DPBS	Corning	21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate	Pierce	32106
Ethanol, 200 proof	Fisher Chemical	A409-4
FBS	Gibco	16000044
Formic Acid	Fisher Chemical	A117-50
GelCode blue stain reagent	ThermoFisher	24590
Glycerol	Fisher Chemical	56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnologies	sc-2005
Iodoacetamide	ACROS Organics	122270050
KimWipe delicate task wiper	Kimberly Clark Professional	34120
L-glutamine	Gibco	25030081
Methanol	Fisher Chemical	67-56-1
NanoAcuity UPLC	Waters	N/A
Pierce Silver Stain Kit	Thermo Scientific	24600df
15-mL Polypropylene conical tube	Falcon	352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa	Thermo Scientific	26616
Protease inhibitor cocktail	Roche	4693132001
Purified BSA	New England Biolabs	B9001
PVDF  Western blotting membrane	Roche	3010040001
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
10 x TBS	Fisher Bioreagents	BP2471500
TEMED	BioRad	1610880edu
Triton X-100 detergent solution	BioRad	1610407
Trizaic source	Waters	N/A
trypsin-EDTA	Corning	25-051-CIS
Tween 20	BioRad	1706531
Synapt G2 mass spectrometer	Waters	N/A
Whatman filter paper	Tisch Scientific	10427813