Denne protokol beskriver en teknik til at afbilde forskellige cellepopulationer i dræne lymfeknuder uden ændringer i organ strukturen.
Lymfeknuder (LNs) er organer spredt i kroppen, hvor den medfødte immunrespons kan forbinde med den adaptive immunitet. Faktisk er LNS strategisk indskudt i vejen for lymfe skibene, så intim kontakt af vævs antigener med alle residente immunceller i LN. Således, forstå den cellulære sammensætning, fordeling, placering og interaktion ved hjælp af ex vivo hele LN Imaging vil tilføje til viden om, hvordan kroppen koordinerer lokale og systemiske immunrespons. Denne protokol viser en ex vivo-billedbehandlings strategi efter en in vivo-administration af fluorescerende-mærkede antistoffer, der muliggør en meget reproducerbar og let-at-udføre metodologi ved hjælp af konventionelle konfokale mikroskoper og lager reagenser. Ved subkutan injektion af antistoffer er det muligt at mærke forskellige cellepopulationer i dræne LNs uden at påvirke vævsstrukturer, der potentielt kan blive beskadiget af en konventionel immunofluorescens mikroskopi teknik.
Lymfeknuder (LNs) er ovoid-formede organer bredt til stede i hele kroppen med den afgørende funktion af bridging den medfødte og adaptive immunrespons. LNs filtrerer lymfeknuder for at identificere fremmede partikler og kræftceller til at montere en immunrespons mod dem1. Antigen præsenterer celler (APCs), T-celler og B-celler arbejde sammen for at generere antigen-specifikke antistoffer (humoral immunitet) og cytotoksiske lymfocytter (cellulære immunitet) for at eliminere fremmede partikler og kræftceller2. Således, forstå dynamikken i immuncellerne til stede i lymfesystemet vil have vigtige konsekvenser for vaccine udvikling og kræft immunterapi.
Fremkomsten af kraftfulde mikroskoper-herunder nye konfokale og super resolution mikroskoper-har tilladt en ekstraordinær avancement i forståelsen af, hvordan forskellige immuncelle populationer opfører sig i deres oprindelige miljø3. Det er nu muligt at afbilde flere samtidige celle-undertyper ved hjælp af en kombination af sonder med genetisk modificerede mus, som udtrykker fluorescerende proteiner under kontrol af specifikke mål4,5. Faktisk, høje dimensionelle teknikker, herunder massecytometri og multi-parametrisk flow analyse har været afgørende for at udvide vores viden om forskellige immuncelle opdeling og funktionalitet i sundhed og sygdom6, 7. men for at forberede prøverne til disse teknikker, væv har brug for fordøjelsen og celler adskilles fra deres naturlige miljø, der skal analyseres i celle suspensioner. For at overgå disse begrænsninger og tillade en bedre oversættelse i biologi, er målet med den foreslåede protokol at anvende en enkel metode til at afbilde ex vivo hele lymfeknuder ved hjælp af lager konfokale mikroskoper med fordel for forbedret hastighed, vævs og cellernes levedygtighed i forhold til den konventionelle immunofluorescens farvning. Ved at bruge denne fremgangsmåde, vi var i stand til at vise, at mus mangelfuld for γδ T celler, en under type af T lymfocyt involveret i vært tidligt forsvar mod patogener4, har kompromitteret follikler og T celle zoner i forhold til vildtype mus. Disse fund gjorde det muligt for os at forfølge en undersøgelse, hvor vi påviste, at γδ T-celler spiller en afgørende rolle i homøostase af lymfoide organer og humorale immunrespons4. Endvidere, denne protokol giver en fysiologisk vej for sonder og antistoffer til at nå lymfeknude, da de administreres subkutant og sprede gennem vævs lymfe kredsløb, bygger på tidligere rapporter, der anvendes in situ mærkning med antistoffer til at visualisere lymfe-associerede strukturer8,9, avlsmateriale Center Dynamics10,11,12, og mål let tilgængelige for blodgennemstrømningen13 ,14,15.
Kombinationen af billeddannelse med andre teknikker, herunder molekylær biologi og højdimensionel immunophenotyping, har forbedret vores evne til at undersøge immunceller i deres oprindelige kontekst. Mens andre tilgange kan kræve vævs fordøjelse og celle isolation – hvilket kan føre til tab af vævs integritet – giver brugen af in vivo-eller ex vivo-billeddannelse en stor fordel i at undersøge forskellige celle undertyper på en geografisk måde3 , 16</sup…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH (R01 AI43458 til H.L.W.).
BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35×10 mm with glass bottom |
Insulin syringes | BD Plastipak | – | Insulin U-100 |
Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
Needle | BD PrecisionGlide | – | 30 gauge × ½ inch |
Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |