पूर्व Vivo Confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर लिम्फ नोड संरचना और सेलुलर स्थानीयकरण कल्पना
Summary
इस प्रोटोकॉल अंग संरचना में परिवर्तन के बिना लिम्फ नोड्स draining में विभिन्न सेल आबादी छवि के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है.
Abstract
लिम्फ नोड्स (LNs) शरीर के भीतर फैले हुए अंग हैं, जहां सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाअनुकूली प्रतिरक्षा के साथ जुड़ सकती है। वास्तव में, LNs रणनीतिक लसीका वाहिकाओं के रास्ते में interposed रहे हैं, LN में सभी निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ ऊतक प्रतिजनों के अंतरंग संपर्क की अनुमति. इस प्रकार, सेलुलर संरचना, वितरण, स्थान और पूर्व vivo पूरे LN इमेजिंग का उपयोग कर बातचीत को समझने कैसे शरीर स्थानीय और प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं निर्देशांक पर ज्ञान के लिए जोड़ देगा. इस प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी है कि पारंपरिक confocal माइक्रोस्कोप और शेयर अभिकर्मकों का उपयोग करके एक बहुत reproducible और आसान करने के लिए प्रदर्शन पद्धति की अनुमति देता है की एक vivo प्रशासन के बाद एक पूर्व vivo इमेजिंग रणनीति से पता चलता है. एंटीबॉडी के subcutaneous इंजेक्शन के माध्यम से, यह ऊतक संरचनाओं है कि संभावित रूप से एक पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी तकनीक से क्षतिग्रस्त हो सकता है को प्रभावित किए बिना LNs draining में विभिन्न सेल आबादी लेबल करने के लिए संभव है.
Introduction
लिम्फ नोड्स (LNs) सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को पाटने के महत्वपूर्ण समारोह के साथ पूरे शरीर में व्यापक रूप से मौजूद ओवॉइड आकार के अंग हैं। एल एन एस विदेशी कणों और कैंसर कोशिकाओं की पहचान करने के लिए लसीका को फिल्टर करता है ताकि उनके खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को माउंटकिया जासके 1 . एंटीजन पेश कोशिकाओं (APCs), टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी उत्पन्न करने के लिए (ह्यूमरल प्रतिरक्षा) और साइटोटॉक्सिक लिम्फोसाइटों (सेलुलर प्रतिरक्षा) विदेशी कणों और कैंसर कोशिकाओं को खत्म करने के लिए2. इस प्रकार, लसीका प्रणाली में मौजूद प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिशीलता को समझने के टीके के विकास और कैंसर इम्यूनोथेरेपी के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ेगा।
नए शंखऔर सुपर रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोप सहित शक्तिशाली सूक्ष्मदर्शी के आगमन ने यह समझने में असाधारण प्रगति की अनुमति दी है कि विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका की आबादी अपने मूल वातावरण में किस प्रकार व्यवहार करती है3. अब आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के साथ जांच के संयोजन का उपयोग करके कई एक साथ सेल उपप्रकारों की छवि करना संभव है जो विशिष्ट लक्ष्यों के नियंत्रण में फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करते हैं4,5. वास्तव में, उच्च आयामी तकनीक, बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री और बहु-पैरामीट्रिक प्रवाह विश्लेषण सहित स्वास्थ्य और रोग6में विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका commentalization और कार्यक्षमता पर हमारे ज्ञान का विस्तार करने के लिए महत्वपूर्ण किया गया है, 7. तथापि, इन तकनीकों के लिए नमूने तैयार करने के लिए, ऊतकों पाचन की जरूरत है और कोशिकाओं को उनके प्राकृतिक वातावरण से अलग कर रहे हैं सेल निलंबन में विश्लेषण किया जा करने के लिए. इन सीमाओं को पार करने और जीव विज्ञान में एक बेहतर अनुवाद की अनुमति देने के लिए, यहाँ प्रस्तावित प्रोटोकॉल का लक्ष्य छवि पूर्व vivo पूरे लिम्फ नोड्स के लिए एक सीधी पद्धति लागू करने के लिए बेहतर गति के लाभ के साथ शेयर confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहा है, ऊतक संरचना संरक्षण, और सेल व्यवहार्यता पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला की तुलना में. इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम यह दिखाने में सक्षम थे कि चूहों की कमी के लिए जेड टी कोशिकाओं, टी लिम्फोसाइट के एक उपप्रकार रोगजनकों के खिलाफ प्रारंभिक रक्षा की मेजबानी में शामिल4, follicles और टी सेल क्षेत्रों के रूप में जंगली प्रकार चूहों की तुलना में समझौता किया है. इन निष्कर्षों ने हमें एक अध्ययन करने की अनुमति दी जिसमें हमने यह प्रदर्शित किया कि लसीकाभ अंगों के होमियोस्टेसिस और हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया4में टी कोशिकाएं महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं . इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल जांच और एंटीबॉडी लिम्फ नोड तक पहुँचने के लिए के लिए एक शारीरिक मार्ग प्रदान करता है, के रूप में वे subcutaneously प्रशासित रहे हैं और ऊतक लसीका परिसंचरण के माध्यम से नष्ट, पिछले रिपोर्ट है कि situ लेबलिंग में इस्तेमाल किया पर निर्माण एंटीबॉडी के साथ लसीका-संबद्ध संरचनाओं की कल्पना करने के लिए8,9, germinal केंद्र गतिशीलता10,11,12, और लक्ष्य रक्त प्रवाह के लिए आसानी से सुलभ13 ,14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
आणविक जीव विज्ञान और उच्च आयामी इम्यूनोफेनोटाइपिंग सहित अन्य तकनीकों के साथ इमेजिंग के संयोजन ने हमारे मूल संदर्भ में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की जांच करने की क्षमता को बढ़ाया है। वास्तव में, जबकि अन्य द?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIH द्वारा समर्थित किया गया था (R01 AI43458 H.L.W.).
Materials
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35×10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | – | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | – | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
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