Visualización de la estructura de los ganglios linfáticos y la localización celular mediante la microscopía confocal Ex-Vivo
Summary
Este protocolo describe una técnica para tomar imágenes de diferentes poblaciones celulares en el drenaje de los ganglios linfáticos sin alteraciones en la estructura del órgano.
Abstract
Los ganglios linfáticos (LN) son órganos diseminados dentro del cuerpo, donde las respuestas inmunitarias innatas pueden conectarse con la inmunidad adaptativa. De hecho, los LN están estratégicamente interpuestos en la trayectoria de los vasos linfáticos, permitiendo el contacto íntimo de antígenos tisulares con todas las células inmunitarias residentes en el LN. Por lo tanto, la comprensión de la composición celular, distribución, ubicación e interacción utilizando imágenes LN enteras ex vivo saque a la forma en que el cuerpo coordina las respuestas inmunitarias locales y sistémicas. Este protocolo muestra una estrategia de imagen ex vivo después de una administración in vivo de anticuerpos con etiqueta fluorescente que permite una metodología muy reproducible y fácil de realizar mediante el uso de microscopios confocales convencionales y reactivos de stock. A través de la inyección subcutánea de anticuerpos, es posible etiquetar diferentes poblaciones celulares en lNes drenantes sin afectar a las estructuras tisulares que pueden ser potencialmente dañadas por una técnica de microscopía de inmunofluorescencia convencional.
Introduction
Los ganglios linfáticos (LN) son órganos en forma de ovoide ampliamente presentes en todo el cuerpo con la función crucial de puentear las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. Los LN filtran la linfa con el fin de identificar partículas extrañas y células cancerosas para montar una respuesta inmune contra ellos1. Las células que presentan antígenos (AAP), las células T y las células B trabajan junto con la generación de anticuerpos específicosde antígenos (inmunidad humoral) y linfocitos citotóxicos (inmunidad celular) para eliminar las partículas extrañas y las células cancerosas 2. Por lo tanto, comprender la dinámica de las células inmunitarias presentes en el sistema linfático tendrá importantes implicaciones para el desarrollo de la vacuna y la inmunoterapia contra el cáncer.
La llegada de poderosos microscopios -incluyendo nuevos microscopios confocales y de superresolución- ha permitido un avance extraordinario en la comprensión de cómo se comportan las diferentes poblaciones de células inmunitarias en su entorno nativo3. Ahora es posible crear una imagen de varios subtipos celulares simultáneos utilizando unacombinación de sondas con ratones modificados genéticamente que expresan proteínas fluorescentes bajo el control de objetivos específicos 4,5. De hecho, las técnicas de alta dimensión, incluida la citometría de masas y el análisis de flujo multiparamétrico han sido cruciales para ampliar nuestros conocimientos sobre la compartimentación y funcionalidad de diferentes células inmunitarias en la salud y la enfermedad6, 7. Sin embargo, para preparar muestras para estas técnicas, los tejidos necesitan digestión y las células se separan de su entorno natural para ser analizadas en suspensiones celulares. Para superar estas limitaciones y permitir una mejor traducción en biología, el objetivo del protocolo propuesto aquí es aplicar una metodología sencilla para la imagen de ganglios linfáticos enteros ex vivo utilizando microscopios confocales con el beneficio de la mejora de la velocidad, el tejido conservación de la estructura y viabilidad celular en comparación con la tinción de inmunofluorescencia convencional. Mediante el uso de este enfoque, pudimos demostrar que los ratones deficientes para las células T,un subtipo de linfocitos T involucrados en la defensa temprana del huésped contra patógenos 4, han comprometido folículos y zonas de células T en comparación con ratones de tipo salvaje. Estos hallazgos nos permitieron realizar un estudio en el que demostramos que las células T desempeñan un papel fundamental en la homeostasis de los órganos linfoides y la respuesta inmune humoral4. Además, este protocolo proporciona una vía fisiológica para que las sondas y los anticuerpos lleguen al ganglio linfático, ya que se administran por vía subcutánea y se disipan a través de la circulación linfática tisular, basándose en informes anteriores que se utilizan en el etiquetado in situ con anticuerpos para visualizar estructuras asociadas a linfáticos8,9, dinámica central germinal10,11,12, y objetivos fácilmente accesibles para el flujo sanguíneo13 ,14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
La combinación de imágenes con otras técnicas, incluida la biología molecular y el inmunofenotipado en alta dimensión, ha mejorado nuestra capacidad de investigar las células inmunitarias en su contexto nativo. De hecho, mientras que otros enfoques pueden requerir la digestión de los tejidos y el aislamiento celular, lo que puede conducir a la pérdida de la integridad del tejido, el uso de imágenes in vivo o ex vivo otorga una gran ventaja en la investigación de diferentes subtipos celulares de forma geográfic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el NIH (R01 AI43458 a H.L.W.).
Materials
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35×10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | – | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | – | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
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