Isolering och färgning av mus hud keratinocyter för cell Cycle specifik analys av cellulära protein uttryck av Masscytometry
Summary
Detta protokoll beskriver hur man isolerar hudkeratinocyter från musmodeller, för att färga med metallmärkta antikroppar, och för att analysera färgade celler av masscytometri för att profilera uttrycksmönstret av proteiner av intresse i de olika cell cykel faserna.
Abstract
Målet med detta protokoll är att upptäcka och kvantifiera protein uttrycks förändringar i en cell cykel beroende sätt med hjälp av enstaka celler isolerade från epidermis av mus huden. Det finns sju viktiga steg: separation av epidermis från dermis, nedbrytning av epidermis, färgning av epidermal cellpopulationer med cisplatin, prov barkodning, färgning med metall märkta antikroppar för cell cykel markörer och proteiner av intresse, detektering av metallmärkta antikroppar av masscytometri, och analys av uttrycket i de olika cellcykeln faser. Fördelen med denna metod över histologiska metoder är potentialen att assay uttrycksmönstret av > 40 olika markörer i en enda cell i olika faser av cellcykeln. Denna metod möjliggör också för multivariat korrelation analys av proteinuttryck som är mer kvantifierbar än histologiska/Imaging metoder. Nackdelen med detta protokoll är att en suspension av enstaka celler behövs, vilket resulterar i förlust av lokaliseringsinformation från färgning av vävnad sektioner. Denna metod kan också kräva införande av ytterligare markörer för att identifiera olika celltyper i rå cellsuspensioner. Tillämpningen av detta protokoll är uppenbar i analysen av hyperplastiska hud sjukdomsmodeller. Dessutom kan detta protokoll anpassas för analys av specifika subtyper av celler (t. ex. stamceller) genom tillsats av härstamning-specifika antikroppar. Detta protokoll kan också anpassas för analys av hudceller i andra försöks arter.
Introduction
Korrelation av genuttryck med cell cykel stadier är fortfarande en utmaning i analysen av djurmodeller av hyperplastiska sjukdomar som cancer. En del av denna utmaning är CO-detektion av proteiner av intresse (POI) med markörer för spridning. Proliferativa celler kan hittas i olika cell cykel faser inklusive G1, S, G2, och M. Ki67 är en av de mest använda markörer för spridning och uttrycks i alla faser av cellcykeln. Det har använts i stor utsträckning i analysen av både mänskliga och mus vävnader1,2,3. Men liksom andra allmänna spridnings markörer, Ki67 inte urskilja enskilda cellcykeln faser. En mer exakt metod använder införlivandet av tymidin nukleotid analoger som bromodeoxyuridine (BrdU) i celler som aktivt replikerar deras arvsmassa (dvs. S-fas)4,5. En nackdel med användningen av nukleotidanaloger är behovet av att administrera dem till levande djur timmar före analys. Ki67 och BrdU upptäcks vanligen på fasta vävnad sektioner genom användning av antikroppar. En fördel med detta tillvägagångssätt är att placeringen av intressepunkter kan fastställas inom vävnads uppbyggnad (t. ex. det basala lagret av hud epidermis). Denna metod kräver inte heller vävnads dissociation som kan leda till förändringar i genuttryck. En nackdel är att vävnaden fixering eller bearbetning av vävnaden för OCT fryst eller paraffin snittning kan ockludera antikropps mål (dvs, antigener). Hämtning av antigener kräver normalt värme eller vävnadsnedbrytning. Kvantifiering av Färgnings intensiteter kan också vara utmanande. Detta beror på variationer i färgning, snittjocklek, signaldetektering och försöksledaren bias. Dessutom kan ett begränsat antal markörer upptäckas samtidigt i de flesta typiska laboratorie uppställningar. Ännu nyare multiplex färgning metoder lovar att övervinna dessa begränsningar; exempel är bildmascytometry och tyramid signalamplifiering6,7.
Flow flödescytometrianalys är en annan kraftfull teknik för att upptäcka prolifererande celler. Det möjliggör multiplex detektion av markörer i samma celler men kräver vävnads dissociation för de flesta icke-hematopoietiska celltyper. Analys av prolifererande celler görs rutinmässigt genom användning av färgämnen som binder DNA (t. ex. Propidium Iodide (PI))8. Flödescytometri medger också en mer exakt bestämning av cellcykelns faser i kombination med detektion av BrdU-inkorporering9. Även om en kraftfull metod, har BrdU/PI Flow flödescytometrianalys sina nackdelar. Det är oförmögen att lösa de G2/M och G0/G1 faser utan införandet av fas-specifika antikroppar. Antalet antikroppar som kan användas begränsas dock av cellulär autofluorescens, spektralspill av fluorophore-utsläpp och användning av kompensationskontroller. Denna begränsning är mer utmanande och mödosam att identifiera uttrycket av cell cykel markörer med POI. En mer facile metod är att använda masscytometry10,11. Denna teknik använder metallkonjugerade antikroppar som har ett smalare detektions spektrum. När celler färgas med metall-märkta antikroppar, de är förgasas, och de metaller som upptäcks av flödescytometrianalys tid-of-Flight (CyTOF) masspektrometri. På grund av dessa egenskaper möjliggör mascytometri multiplex-detektion av > 40 olika markörer som använder befintliga plattformar10,11. Dessutom är det möjligt att streckkods prov med metaller som resulterar i besparingar av värdefulla antikroppar samtidigt minska prov-to-Sample färgning variation. Å andra sidan, masscytometry har flera nackdelar. Det finns ett begränsat antal kommersiellt tillgängliga metallmärkta antikroppar för icke-blodhärledda celler. Kvantifiering av DNA-halten är mindre känslig jämfört med användning av fluorescerande DNA-färgämnen och masscytometri har ett minskat dynamiskt omfång av signaldetektering jämfört med fluorescensflödescytometri.
Det protokoll som beskrivs här var utformat för att analysera cellcykelns dynamik från nyligen isolerade keratinocyter (KCs) från mus huden och karakterisera cellcykelns specifika proteinuttryck i dessa celler med hjälp av masscytometri. Detta protokoll kan också användas med odlade celler eller anpassas till andra celltyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det protokoll som beskrivs i detta dokument kan fyllas i ca 8 h. Slutresultatet är en suspension av celler berikade i KCs som kan analyseras för proteinuttryck i ett cell cykel beroende sätt. Flera tidigare studier har skisserat metoder för att isolera KCS från människa och mus hud16,25. Dessa studier omfattar även protokoll för isolering av KCs för flödescytometri26. Ett detaljerat protokoll har dock inte beskrivits tidigare som…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stöd för detta arbete kom från Institutionen för dermatologi, Gates Center for regenerativ medicin vid University of Colorado och University of Colorado (UC) hudsjukdom Center morfologi och fenotypning kärnor (NIAMS P30 AR057212). Författarna erkänner UC Cancer Center Flow cytometry delad resurs och stöd bidrag (NCI P30 CA046934) för driften av massan flödescytometerns och är tacksamma för Karen Helm och Christine Childs i centrum för deras expertråd om flöde och massa kors Tekniker.
Materials
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM – Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
References
- Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
- Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
- Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
- Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
- Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
- Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
- Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
- Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
- Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. 암 연구학. 69 (18), 7207-7215 (2009).
- Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).
