自动 3D 光学相干断层扫描，以在大型空间尺度上阐明生物膜变形
Summary
微生物生物膜在相间形成复杂的结构，并发展成高度依赖于尺度的空间模式。在这里，我们介绍了一个实验系统（硬和软件），用于自动采集3D光学相干断层扫描（OCT）数据集。此工具集允许在空间和时间中对生物膜形态发生进行非侵入性和多尺度表征。
Abstract
生物膜是一种最成功的微生物生活方式，在众多环境和工程环境中盛行。理解生物膜形态，即社区组装期间生物膜的结构多样化，是空间和时间尺度上的一个显著挑战。在这里，我们提出了一个基于光学相干断层扫描（OCT）的自动化生物膜成像系统。OCT是生物膜研究中新兴的成像技术。然而，目前可以获取和处理的数据量妨碍了生物膜形态中大规模模式的统计推论。自动化的OCT成像系统可以覆盖生物膜生长的大空间和扩展时间尺度。它将市售的OCT系统与机器人定位平台和一套软件解决方案相结合，用于控制OCT扫描探头的定位，以及3D生物膜成像数据集的采集和处理。此设置允许对生物膜开发进行原位和非侵入性的自动监测，并可能进一步开发，将 OCT 成像与宏观摄影和微传感器分析结合。
Introduction
生物膜是一种非常成功的微生物生活方式适应，这些相间相关和基质封闭的微生物群落在自然和工业环境中主导微生物生命1、2。在那里，生物膜形成复杂的结构，如长流器3，波纹4或蘑菇状帽5，对生物膜生长、结构稳定性和抗应力性有重要影响。虽然从微型流动室中生长的单一物种培养物的工作中学到了很多关于生物膜结构分化的知识，但大多数生物膜都是高度复杂的群落，通常包括生命所有领域的成员。因此，将这些复杂的生物膜理解为微生物景观7，并了解生物膜结构和功能在复杂社区中如何相互作用，是生物膜研究的前沿。
要根据环境线索对复杂生物膜的形态形成进行机械性理解，就必须结合空间和时间解决的对相关生物膜物理结构的观测进行精心设计的实验比例8.然而，对实验系统中生物膜生长的非破坏性观察受到后勤限制的严重限制，例如需要将样品（例如，转移到显微镜上）经常破坏脆弱的生物膜结构。
此处提出的协议引入了基于光学相干断层扫描 （OCT） 的全自动系统，允许在中尺度（mm 范围）对生物膜形态发生进行原位、非侵入性监测。OCT是生物膜研究的新兴成像技术，在水处理和生物污染研究、医学9和河流生态学10中的应用。在OCT中，低相干光源被分割成样品和参考臂;分析了生物膜（样品臂）和参考臂光反射和散射的光的干扰。获取一系列轴向强度轮廓（A 扫描），其中包含深度解析的结构信息，并合并到 B 扫描（横截面）。一系列相邻的B扫描组成最后的3D卷扫描10。OCT提供约10μm范围内的横向光学分辨率，因此非常适合研究生物膜10、12的中观结构分化。有关OCT的更详细描述，请参阅德雷克斯勒和藤本13和费彻及其同事14。尽管单个 OCT xy 扫描的视场面积达数百平方千米，但大型模式无法通过单次扫描的 OCT 进行量化。关于溪流和河流等自然生境的生物膜，这限制了我们评估生物膜形态形成的能力，其规模与生境的物理和水力模板相匹配。
为了超越这些空间极限并自动获取OCT扫描，在3轴定位系统上安装了光谱域OCT成像探头。该安装允许以重叠的马赛克图案（切片扫描）获取多个 OCT 扫描，从而有效地实现高达 100 cm2的表面区域的断层成像。此外，该系统的高定位精度能够在长期实验中可靠地监测特定部位的生物膜特征的生长和发育。该系统为模块化，安装的各个组件（即定位装置和OCT）可用作独立解决方案或灵活组合。图 1概述了安装的硬组件和软件组件。
该系统使用市售GRBL控制的CNC定位装置（材料表）进行测试。该特定定位平台的工作距离为 600*840*140 mm，制造商指示的精度为 +/- 0.05 mm，可编程分辨率为 0.005 mm。 GRBL 是开源（GPLv3 许可证），用于 CNC 的高性能运动控制设备。因此，每个基于 GRBL 的定位设备（版本 > 1.1）都应与此处提供的指南和软件包兼容。此外，该软件可以适应其他步进电机控制器STEP-DIR输入类型，很少修改。
用于评估系统性能的 OCT 设备（材料表）具有低相干性光源，中心波长为 930 nm（带宽 = 160 nm），可调节参考臂长度和强度。在此处介绍的示例中，还使用了用于将 OCT 探头浸入流水中的浸入式适配器（材料表）。此处为自动 OCT 扫描采集开发的软件包主要取决于与特定 OCT 系统一起提供的 SDK，但是，来自不同扫描镜头和中央波长的同一制造商的 OCT 系统应易于兼容。
GRBL 设备由安装在单板计算机上的 Web 服务器控制（图 1）。这授予从任何具有本地网络或 Internet 访问权限的计算机对设备的远程控制。OCT 设备由单独的计算机控制，允许 OCT 系统在自动实验设置之外运行。最后，软件包包括用于同步 OCT 探头定位和 OCT 扫描采集的库（即，以镶嵌模式或一组定义位置自动获取 3D 成像数据集）。在 3D 中有效地定义 OCT 探头的位置，可以针对（区域）扫描集调整焦平面。具体而言，在不平坦的表面上，可以为每个 OCT 扫描指定不同的焦平面（即 z 方向的不同位置）。
开发了一组软件包来处理原始的OCT扫描（表1）。定位设备的导航、OCT 扫描采集和数据集处理均使用 Python 编码的 Jupyter 笔记本电脑执行，从而在软件开发和优化方面具有显著的灵活性。此类笔记本的两个工作示例和批注示例（分别用于图像采集和处理）可从https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git 它们旨在作为自定义的起点方法。Jupyter 笔记本是基于 Web 浏览器的应用程序，其中包含带有带条形码的 Python 代码的单元格。每个步骤都包含在笔记本的单元格中，可以单独执行。由于穿过扫描透镜的光路长度不同（球面像差）15，原始OCT扫描出现失真（图2A）。我们开发了一种算法来自动纠正在获取的OCT扫描（包含在图像处理.ipynb，补充文件1）中的这种失真。此外，生物膜形态可以可视化为二维高程图，如之前在膜系统16中使用的，我们说明了如何缝合从切片阵列中采集的扫描获得的高程图。
最后，通过烟流实验说明了所述实验室装置的功能，其中光营养流生物膜暴露于流速梯度。
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT 成像非常适合在微米范围内解决结构，FOV 为几平方毫米。因此，它是生物膜研究的有力工具10，18。然而，OCT目前被限制在100-256毫米2的最大扫描面积，而生物膜结构模式往往超过这个空间尺度19，特别是当形态分化是由大规模环境梯度驱动时20.该协议中描述的自动OCT成像系统将OCT特征的表面面积扩大到几?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢毛里西奥·阿吉雷·莫拉莱斯为这一制度的发展所作的贡献。 瑞士国家科学基金会向T.J.B.提供财政支助。
Materials
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
References
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).
- Flemming, H. -. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature reviews. Microbiology. 14, 563 (2016).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop. Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).
- Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Microbiology. 14, 251-263 (2016).
- Battin, T. J., et al. Microbial landscapes: new paths to biofilm research. Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).
- Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm. J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002 (2016).
- Wagner, M., Horn, H. Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review. Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
- Haisch, C., Niessner, R. Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography. Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. . Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , (2008).
- Fercher, A. F. Optical coherence tomography – development, principles, applications. Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).
- Lee, H. -. C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy. Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).
- Fortunato, L., Leiknes, T. In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping. Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).
- Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).
- Roche, K. R., et al. Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams. Water Resources. 53, 222-236 (2016).
- Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor. Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).
