Automatiseret 3D optisk kohærens tomografi til at belyse biofilm Morfogenesis over store rumlige skalaer
Summary
Mikrobielle biofilmer danner komplekse arkitekturer ved interfaser og udvikler sig til meget skala afhængige rumlige mønstre. Her introducerer vi et eksperimentelt system (Hard-og software) til automatiseret erhvervelse af 3D optisk kohærens tomografi (OCT) datasæt. Dette værktøjsæt tillader ikke-invasiv og multi-skala karakterisering af biofilm morfogenese i rum og tid.
Abstract
Biofilms er en mest succesfuld mikrobiel livsstil og fremherskende i en lang række miljømæssige og konstruerede indstillinger. Forståelse af biofilm morfogenese, det er den strukturelle diversificering af biofilmer under Fællesskabs forsamlingen, repræsenterer en bemærkelsesværdig udfordring på tværs af rumlige og tidsmæssige skalaer. Her præsenterer vi et automatiseret biofilm billedsystem baseret på optisk kohærens tomografi (OCT). OCT er en spirende billeddannelses teknik i biofilm Research. Mængden af data, der i øjeblikket kan erhverves og behandles, hæmmer imidlertid den statistiske slutning af store mønstre i biofilm morfologi. Det automatiserede OLT-billedbehandlingssystem giver mulighed for at dække store rumlige og udvidede tidsmæssige skalaer for biofilm vækst. Det kombinerer et kommercielt tilgængeligt OLT-system med en robot positionerings platform og en række softwareløsninger til at styre placeringen af OLT-scannings sonden samt erhvervelse og behandling af 3D biofilm-billedbehandlings datasæt. Dette setup giver mulighed for in situ og ikke-invasiv automatiseret monitorering af biofilm udvikling og kan videreudvikles til par OCT Imaging med makrofotografering og mikrosensor profilering.
Introduction
Biofilms er en meget vellykket mikrobiel livsstil tilpasning og disse Interphase-associerede og matrix-indesluttet samfund af mikroorganismer dominerer mikrobielle liv i naturlige og industrielle indstillinger1,2. Der, biofilm danner komplekse arkitekturer, såsom aflange streamere3, krusninger4 eller champignon-lignende caps5 med vigtige konsekvenser for biofilm vækst, strukturel stabilitet og modstandsdygtighed over for stress6. Mens meget om biofilm strukturel differentiering er blevet lært fra arbejde på mono-arter kulturer dyrket i miniature flow kamre, de fleste biofilm er meget komplekse samfund, der ofte omfatter medlemmer af alle områder af livet6. At værdsætte disse komplekse biofilder som mikrobielle landskaber7 og forstå, hvordan biofilm struktur og funktion interagerer i komplekse samfund er således på forkant med biofilm forskning.
En mekanistisk forståelse af morfogenesen af komplekse biofilm som reaktion på Miljøsignaler kræver omhyggeligt udformede eksperimenter sammen med rumligt og timeligt løste observationer af den fysiske struktur af biofilder på tværs af relevante vægte8. Den ikke-destruktive observation af biofilm-væksten i forsøgssystemer er imidlertid blevet stærkt begrænset af logistiske begrænsninger såsom behovet for at flytte prøver (f. eks. til et mikroskop), der ofte skader den delikate biofilm struktur.
Protokollen præsenteres her introducerer et fuldt automatiseret system baseret på optisk kohærens tomografi (Oct), som tillader in situ, ikke-invasiv overvågning af biofilm morfogenese på en (mm rækkevidde). Oct er en spirende billeddannelses teknik i biofilm forskning med anvendelser i vandbehandling og foulingmiljø forskning, medicin9 og Stream økologi10. I OLT opdeles en lyskilde med lav sammenhæng i en prøve-og reference arm. interferensen af det lys, der reflekteres og spredes af biofilm (prøve armen) og lyset fra reference armen, analyseres. En række aksiale intensitets profiler (A-scanninger), som indeholder dybde-løste strukturelle oplysninger er erhvervet og fusioneret til en B-scanning (et tværsnit). En række tilstødende B-scanninger komponerer den endelige 3D-volumen scanning10. Oct giver en lateral optisk opløsning i intervallet ca. 10 μm og er derfor velegnet til at studere mesoskopisk strukturel differentiering af biofilm10,12. For en mere detaljeret beskrivelse af OLT henvises til Drexler og Fujimoto13og fercher og kolleger14. Selv om det synsfelt af en enkelt OLT XY-scanning når op til hundredvis af firkantede mikrometer, kan større skala mønstre ikke kvantificeres ved hjælp af OLT i en enkelt scanning. Med hensyn til biofilm i naturlige habitater som vandløb og floder begrænser dette i øjeblikket vores evne til at vurdere biofilden morfogenese på skalaer, der matcher den fysiske og hydrauliske skabelon af habitat.
For at overgå disse rumlige grænser og for at erhverve OCT scanninger automatisk, en spektral-domæne OCT Imaging Probe blev monteret på en 3-akse positionering system. Installationen tillader erhvervelse af flere Oct scanninger i et overlappende mosaik mønster (flise scanning), effektivt at opnå tomografisk Imaging af overfladearealer op til 100 cm2. Desuden gør dette Systems høje positionerings præcision det muligt pålideligt at overvåge væksten og udviklingen af biofilm-funktioner på bestemte steder under længerevarende eksperimenter. Systemet er modulært og individuelle komponenter (dvs. positionering enhed og OLT) af anlægget kan bruges som standalone løsninger eller fleksibelt kombineret. Figur 1 giver en oversigt over hard-og softwarekomponenterne i installationen.
Systemet blev testet med en kommercielt tilgængelig GRBL-kontrolleret CNC positionering enhed (tabel over materialer). Drifts afstanden for denne specifikke positionerings platform er 600 × 840 × 140 mm, med en fabrikant-angivet nøjagtighed på +/-0,05 mm og en programmerbar opløsning på 0,005 mm. GRBL er en open source (GPLv3 licens), højtydende bevægelsesstyring til CNC Enheder. Derfor bør alle GRBL-baserede (version > 1,1) positionerings enheder være kompatible med de retningslinjer og softwarepakker, der præsenteres her. Desuden kan softwaren tilpasses andre stepmotor controllere med trin-DIR INPUTTYPE med få modifikationer.
OLT-enheden, der anvendes til at vurdere systemets ydeevne (tabel over materialer), har en lyskilde med lav sammenhæng med en midterbølge længde på 930 nm (båndbredde = 160 nm) og justerbar reference Armlængde og-intensitet. I eksemplet præsenteret her, en nedsænkning adapter til dypning af OLT sonde i strømmende vand blev også brugt (tabel over materialer). Den softwarepakke udviklet her til automatiseret OLT scanning erhvervelse kritisk afhænger af SDK leveres sammen med det specifikke OLT-system, dog, OLT-systemer fra samme producent med forskellige scannings linser og centrale bølgelængder bør være let kompatible.
GRBL-enheden styres af en webserver, der er installeret på en computer med enkelt kort (figur 1). Dette giver fjernstyring af enheden fra enhver computer med lokale netværk eller internetadgang. OLT-enheden styres af en separat computer, der tillader driften af OLT-systemet til side den automatiserede eksperimentelle opsætning. Endelig, softwarepakkerne omfatter biblioteker til at synkronisere OCT Probe positionering og OLT scanning erhvervelse (dvs. at automatisk erhverve 3D imaging datasæt i en mosaik mønster eller i et sæt definerede positioner). Definere placeringen af OCT sonde i 3D effektivt gør det muligt at justere brændplanet specifikt for (regionale) sæt af scanninger. Specifikt på ujævne overflader kan forskellige målfly (dvs. forskellige positioner i z-retningen) specificeres for hver OLT-scanning.
Et sæt softwarepakker blev udviklet til at behandle rå OCT scanninger (tabel 1). Navigation af positionering enhed, OCT scanning erhvervelse og datasæt behandling udføres med Python-kodet Jupyter notebooks, som giver mulighed for bemærkelsesværdig fleksibilitet i udviklingen og optimering af softwaren. To arbejdede og kommenterede eksempler på sådanne notesbøger (til henholdsvis billed erhvervelse og-behandling) er tilgængelige fra https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git de er beregnet som udgangspunkt for tilpasning af metoden. En Jupyter notesbog er et webbrowser baseret program, der indeholder celler med kommenteret Python-kode. Hvert trin er indeholdt i en celle i notesbogen, som kan udføres separat. På grund af den forskellige længde af lysbanen gennem scannings linsen (sfærisk aberration)15, vises de rå Oct-scanninger forvrænget (figur 2a). Vi udviklede en algoritme til automatisk at korrigere for denne forvrængning i erhvervede OCT scanninger (indeholdt i Imageprocessing. ipynb, supplerende fil 1). Desuden kan biofilm morfologi visualiseres som et 2D-højde kort, som tidligere blev brugt i membransystemer16, og vi illustrerer, hvordan højde kort opnået fra scanninger taget i en flisebelægning kan sys.
Endelig illustreres funktionaliteten af den beskrevne laboratorieinstallation ved hjælp af et Flume-eksperiment, hvor fototrofisk Stream biofilm udsættes for en gradient af strømningshastigheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT Imaging er velegnet til at løse strukturer i mikrometer området med en FOV på flere kvadrat millimeter. Det er således et effektivt værktøj til forskning i biofilm10,18. Men, OCT er i øjeblikket begrænset til et maksimum Scan område på 100-256 mm2, mens biofilm strukturelle mønstre ofte overstiger denne rumlige skala19, især når morfologiske differentiering er drevet af store miljømæssige gradienter <sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Mauricio Aguirre Morales for hans bidrag til udviklingen af dette system. Finansiel støtte kom fra Swiss National Science Foundation til T.J.B.
Materials
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
References
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).
- Flemming, H. -. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature reviews. Microbiology. 14, 563 (2016).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop. Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).
- Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Microbiology. 14, 251-263 (2016).
- Battin, T. J., et al. Microbial landscapes: new paths to biofilm research. Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).
- Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm. J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002 (2016).
- Wagner, M., Horn, H. Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review. Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
- Haisch, C., Niessner, R. Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography. Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. . Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , (2008).
- Fercher, A. F. Optical coherence tomography – development, principles, applications. Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).
- Lee, H. -. C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy. Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).
- Fortunato, L., Leiknes, T. In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping. Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).
- Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).
- Roche, K. R., et al. Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams. Water Resources. 53, 222-236 (2016).
- Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor. Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).
