बड़े स्थानिक तराजू पर स्पष्ट बायोफिल्म Morphogenesis के लिए स्वचालित 3 डी ऑप्टिकल सामंजस्य टॉमोग्राफी
Summary
सूक्ष्मजीवी जैवफिल्में इंटरफेज में जटिल आर्किटेक्चर बनाती हैं और अत्यधिक पैमाने पर निर्भर स्थानिक पैटर्न में विकसित होती हैं। यहाँ, हम 3 डी ऑप्टिकल सामंजस्य टोमोग्राफी (OCT) डेटासेट के स्वचालित अधिग्रहण के लिए एक प्रयोगात्मक प्रणाली (हार्ड और सॉफ्टवेयर) पेश करते हैं। इस toolset अंतरिक्ष और समय में biofilm morphogenesis के गैर इनवेसिव और बहु पैमाने पर विशेषता की अनुमति देता है.
Abstract
Biofilms एक सबसे सफल माइक्रोबियल जीवन शैली है और पर्यावरण और इंजीनियर सेटिंग्स की एक भीड़ में प्रबल. जैवफिल्म रूपजनन को समझना, जो सामुदायिक सम्मेलन के दौरान जैव फिल्मों का संरचनात्मक विविधीकरण है, स्थानिक और लौकिक पैमाने पर एक उल्लेखनीय चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। यहाँ, हम ऑप्टिकल सामंजस्य टोमोग्राफी (OCT) पर आधारित एक स्वचालित बायोफिल्म इमेजिंग सिस्टम प्रस्तुत करते हैं। OCT biofilm अनुसंधान में एक उभरती इमेजिंग तकनीक है. तथापि, वर्तमान में प्राप्त और संसाधित किए जा सकने वाले आंकड़ों की मात्रा बायोफिल्म आकारिकी में बड़े पैमाने पर पैटर्न के सांख्यिकीय अनुमान को बाधित करती है। स्वचालित ओसीटी इमेजिंग प्रणाली बायोफिल्म विकास के बड़े स्थानिक और विस्तारित अस्थायी तराजू को कवर करने की अनुमति देता है। यह एक रोबोट स्थिति मंच और सॉफ्टवेयर समाधान के एक सूट के साथ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध OCT प्रणाली को जोड़ती है OCT स्कैनिंग जांच की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए, साथ ही अधिग्रहण और 3 डी biofilm इमेजिंग डेटासेट के प्रसंस्करण. इस सेटअप में situ और गैर इनवेसिव बायोफिल्म विकास की स्वचालित निगरानी की अनुमति देता है और आगे मैक्रोफोटोग्राफी और microsensor रूपरेखा के साथ कुछ OCT इमेजिंग के लिए विकसित किया जा सकता है.
Introduction
बायोफिल्म्स एक अत्यंत सफल माइक्रोबियल जीवन शैली अनुकूलन हैं और सूक्ष्मजीवों के इन अंतर-कलाज-संबद्ध और मैट्रिक्स-संलग्न समुदाय प्राकृतिक और औद्योगिक सेटिंग्स1,2में माइक्रोबियल जीवन पर हावी हैं। वहाँ, बायोफिल्म्स जटिल आर्किटेक्चर का निर्माणकरती हैं, जैसे लम्बी स्ट्रीमर 3, लहर4 या मशरूम की तरह टोपियां5 बायोफिल्म विकास, संरचनात्मक स्थिरता और तनाव के लिए प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण परिणामों के साथ6. जबकि biofilm संरचनात्मक भेदभाव के बारे में बहुत लघु प्रवाह कक्षों में विकसित मोनो प्रजातियों संस्कृतियों पर काम से सीखा गया है, सबसे biofilms अत्यधिक जटिल समुदायों अक्सर जीवन के सभी डोमेन के सदस्यों सहित कर रहे हैं6. माइक्रोबियल परिदृश्य7 के रूप में इन जटिल biofilms की सराहना करते हुए और समझ कैसे biofilm संरचना और समारोह जटिल समुदायों में बातचीत इस प्रकार biofilm अनुसंधान के मामले में सबसे आगे है.
पर्यावरणीय संकेतों के प्रत्युत्तर में जटिल बायोफिल्म्स के रूपजनन की एक यंत्रवादी समझ के लिए प्रासंगिक भर में बायोफिल्म भौतिक संरचना के स्थानिक और लौकिक रूप से हल किए गए प्रेक्षणों के साथ संयोजन के रूप में सावधानीपूर्वक डिजाइन किए गए प्रयोगों की आवश्यकता होती है। तराजू8| हालांकि, प्रयोगात्मक प्रणालियों में biofilm विकास के गैर विनाशकारी अवलोकन गंभीर रूप से इस तरह के नमूने ले जाने की जरूरत के रूप में रसद बाधाओं द्वारा सीमित किया गया है (जैसे, एक माइक्रोस्कोप के लिए) अक्सर नाजुक biofilm संरचना को नुकसान पहुँचा.
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल ऑप्टिकल सामंजस्य टोमोग्राफी (OCT) के आधार पर एक पूरी तरह से स्वचालित प्रणाली का परिचय है, जो insitu की अनुमति देता है, biofilm morphogenesis के गैर इनवेसिव निगरानी mesoscale (मिमी रेंज). OCT पानी के उपचार और biofouling अनुसंधान, दवा9 और धारा पारिस्थितिकी10में अनुप्रयोगों के साथ biofilm अनुसंधान में एक उभरती इमेजिंग तकनीक है. OCT में, एक कम सामंजस्य प्रकाश स्रोत एक नमूना और संदर्भ हाथ में विभाजित है; प्रकाश के हस्तक्षेप परावर्तित और biofilm (नमूना हाथ) द्वारा बिखरे हुए और संदर्भ हाथ के प्रकाश का विश्लेषण किया है. अक्षीय तीव्रता प्रोफाइल (ए-स्कैन) की एक श्रृंखला जिसमें गहराई से हल की गई संरचनात्मक जानकारी शामिल है, का अधिग्रहण किया जाता है और बी-स्कैन (एक क्रॉस सेक्शन) में विलय कर दिया जाता है। आसन्न बी स्कैन की एक श्रृंखला अंतिम 3 डी मात्रा स्कैन10composes. ओसीटी लगभग 10 डिग्री मीटर की सीमा में एक पार्श्विक ऑप्टिकल संकल्प प्रदान करता है और इसलिए बायोफिल्म्स10,12के मध्यदर्शी संरचनात्मक विभेद का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है . OCT के एक अधिक विस्तृत विवरण के लिए, Drexler और फ़ूजीमोटो13और Fercher और उनके सहयोगियों14को देखें. हालांकि एक एकल OCT xy-स्कैन के क्षेत्र के दृश्य वर्ग micrometers के सैकड़ों तक पहुँच जाता है, बड़े पैमाने पर पैटर्न एक ही स्कैन में OCT के माध्यम से मात्रा निर्धारित नहीं किया जा सकता है. नदियों और नदियों जैसे प्राकृतिक आवासों में बायोफिल्मों के संबंध में, यह वर्तमान में निवास के भौतिक और हाइड्रोलिक टेम्पलेट से मेल खाने वाले पैमानों पर बायोफिल्म मॉर्पोजेनेसिस का आकलन करने की हमारी क्षमता को सीमित करता है।
आदेश में इन स्थानिक सीमा को पार करने के लिए और स्वचालित रूप से OCT स्कैन प्राप्त करने के लिए, एक वर्णक्रमीय डोमेन OCT इमेजिंग जांच एक 3-अक्ष स्थिति प्रणाली पर रखा गया था. स्थापना एक ओवरलैपिंग मोज़ेक पैटर्न (टाइल स्कैन) में कई OCT स्कैन के अधिग्रहण की अनुमति देता है, प्रभावी ढंग से 100 सेमी2तक सतह क्षेत्रों के tomographic इमेजिंग को प्राप्त करने. इसके अलावा, इस प्रणाली की उच्च स्थिति परिशुद्धता मज़बूती से विकास और लंबी अवधि के प्रयोगों के दौरान विशिष्ट साइटों में biofilm सुविधाओं के विकास की निगरानी करने के लिए सक्षम बनाता है. प्रणाली मॉड्यूलर और व्यक्तिगत घटक है (यानी, स्थिति डिवाइस और OCT) स्थापना के स्टैंडअलोन समाधान या flexibly संयुक्त के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्र 1 स्थापना के हार्ड- और सॉफ़्टवेयर घटकों का ओवरव्यू प्रदान करता है.
प्रणाली एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध GRBL नियंत्रित सीएनसी स्थिति उपकरण (सामग्री की तालिका)केसाथ परीक्षण किया गया था. इस विशिष्ट स्थिति मंच के ऑपरेटिंग दूरी 600 “840 ] 140 मिमी, एक निर्माता के साथ संकेत सटीकता +/ – 0.05 मिमी और 0.005 मिमी के एक प्रोग्राम संकल्प GRBL एक खुला स्रोत है (GPLv3 लाइसेंस), सीएनसी के लिए उच्च प्रदर्शन गति नियंत्रण उपकरणों. इसलिए, हर GRBL आधारित (संस्करण gt; 1.1) स्थिति डिवाइस दिशा निर्देशों और सॉफ्टवेयर यहाँ प्रस्तुत संकुल के साथ संगत होना चाहिए. इसके अलावा, सॉफ्टवेयर कुछ संशोधनों के साथ कदम-DIR इनपुट प्रकार के साथ अन्य stepmotor नियंत्रकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
सिस्टम के निष्पादन का आकलन करने के लिए प्रयुक्त ओसीटी डिवाइस (सामग्री की तालिका) में 930 दउ (बैंडविड्थ ] 160 दउ) और समायोज्य संदर्भ भुंलना लंबाई और तीव्रता के केंद्र तरंगदैर्ध्य के साथ कम सामंजस्य प्रकाश स्रोत है। यहाँ प्रस्तुत उदाहरण में, ओसीटी जांच को बहते पानी में डुबोने के लिए एक विसर्जन अनुकूलक का भी उपयोग किया गया था (सामग्री की तालिका) । स्वचालित OCT स्कैन अधिग्रहण के लिए यहाँ विकसित सॉफ्टवेयर पैकेज गंभीर रूप से विशिष्ट OCT प्रणाली के साथ एक साथ प्रदान की एसडीके पर निर्भर करता है, हालांकि, अलग स्कैन लेंस और केंद्रीय तरंगदैर्ध्य के साथ एक ही निर्माता से OCT सिस्टम होना चाहिए आसानी से संगत.
GRBL डिवाइस एक एकल बोर्ड कंप्यूटर पर स्थापित एक वेब सर्वर द्वारा नियंत्रित किया जाता है (चित्र1). यह स्थानीय नेटवर्क या इंटरनेट का उपयोग के साथ किसी भी कंप्यूटर से डिवाइस के रिमोट कंट्रोल अनुदान. OCT डिवाइस एक अलग कंप्यूटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है, OCT प्रणाली के संचालन की अनुमति एक तरफ स्वचालित प्रयोगात्मक सेटअप. अंत में, सॉफ्टवेयर संकुल OCT जांच स्थिति और OCT स्कैन अधिग्रहण सिंक्रनाइज़ करने के लिए पुस्तकालयों में शामिल हैं (यानी, स्वचालित रूप से एक मोज़ेक पैटर्न में या परिभाषित पदों का एक सेट में 3 डी इमेजिंग डेटासेट प्राप्त करने के लिए). 3 डी में OCT जांच की स्थिति को परिभाषित प्रभावी ढंग से स्कैन के (क्षेत्रीय) सेट के लिए विशेष रूप से फोकल विमान को समायोजित करने के लिए अनुमति देता है. विशेष रूप से, असमान सतहों पर, विभिन्न फोकल विमानों (यानी, z दिशा में विभिन्न पदों) प्रत्येक OCT स्कैन के लिए निर्दिष्ट किया जा सकता है.
कच्चे ओसीटी स्कैन (सारणी 1) को संसाधित करने के लिए सॉफ्टवेयर पैकेजों का एक सेट विकसित किया गया था। स्थिति डिवाइस के नेविगेशन, OCT स्कैन अधिग्रहण और डेटासेट प्रसंस्करण पायथन कोडित Jupyter नोटबुक, जो विकास और सॉफ्टवेयर के अनुकूलन में उल्लेखनीय लचीलापन की अनुमति के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. दो काम किया और ऐसी पुस्तिकाओं के एनोटेट उदाहरण (छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण के लिए, क्रमशः) https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git वे अनुकूलन के लिए प्रारंभिक अंक के रूप में इरादा कर रहे हैं से उपलब्ध हैं विधि की. एक Jupyter नोटबुक एक वेब ब्राउज़र आधारित अनुप्रयोग है जो एनोटेटेड पायथन कोड के साथ कोशिकाओं को शामिल है. प्रत्येक चरण नोटबुक के एक सेल में निहित है, जो अलग से निष्पादित किया जा सकता है. स्कैन लेंस (गोलीय विपथन)15के माध्यम से प्रकाश पथ की विभिन्न लंबाई के कारण कच्चे ओसीटी स्कैन विकृत दिखाई देते हैं (चित्र 2क) . हमने अधिग्रहीत OCT स्कैन में इस विरूपण को स्वचालित रूप से ठीक करने के लिए एक एल्गोरिथ्म विकसित किया है (ImageProcessing.ipynb, अनुपूरक फ़ाइल 1)में निहित है। इसके अलावा, biofilm आकारिकी एक 2 डी ऊंचाई नक्शे के रूप में कल्पना की जा सकती है, के रूप में पहले झिल्ली प्रणालियों में इस्तेमाल किया गया था16, और हम वर्णन कैसे ऊंचाई नक्शे एक टाइल सरणी में लिया स्कैन से प्राप्त सिले जा सकता है.
अंत में, वर्णित प्रयोगशाला स्थापना की कार्यक्षमता एक flume प्रयोग जिसमें phototrophic धारा biofilm प्रवाह वेग की एक ढाल को उजागर किया जाता है का उपयोग कर सचित्र है.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT इमेजिंग अच्छी तरह से कई वर्ग मिलीमीटर के एक FOV के साथ micrometer रेंज में संरचनाओं को हल करने के लिए अनुकूल है. इस प्रकार यह बायोफिल्म अनुसंधान10,18के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है . हालांकि, OCT व?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस प्रणाली के विकास के लिए उनके योगदान के लिए मौरिसियो Aguirre Morales धन्यवाद. वित्तीय सहायता स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से T.J.B. के लिए आया था.
Materials
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
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