Tomografia a coerenza ottica 3D automatizzata per chiarire la morfogenesi del biofilm su grandi scale spaziali
Summary
I biofilm microbici formano architetture complesse a interfasi e si sviluppano in modelli spaziali altamente dipendenti dalla scala. Qui, introduciamo un sistema sperimentale (hard e software) per l’acquisizione automatizzata di set di dati di tomografia a coerenza ottica 3D (OCT). Questo set di strumenti consente la caratterizzazione non invasiva e multiscala della morfogenesi dei biofilm nello spazio e nel tempo.
Abstract
I biofilm sono uno stile di vita microbico di maggior successo e prevalgono in una moltitudine di ambienti ambientali e ingegnerizzati. Comprendere la morfogenesi dei biofilm, cioè la diversificazione strutturale dei biofilm durante l’assemblaggio della comunità, rappresenta una sfida notevole su scale spaziali e temporali. Qui presentiamo un sistema automatizzato di imaging di biofilm basato sulla tomografia a coerenza ottica (OCT). L’OCT è una tecnica di imaging emergente nella ricerca sui biofilm. Tuttavia, la quantità di dati che attualmente possono essere acquisiti ed elaborati ostacola l’inferenza statistica di modelli su larga scala nella morfologia dei biofilm. Il sistema di imaging automatizzato dello OCT consente di coprire ampie scale temporali spaziali ed estese della crescita dei biofilm. Combina un sistema OCT disponibile in commercio con una piattaforma di posizionamento robotico e una suite di soluzioni software per controllare il posizionamento della sonda di scansione dello Strumento di personalizzazione di Office, nonché l’acquisizione e l’elaborazione di set di dati di imaging di biofilm 3D. Questa configurazione consente il monitoraggio automatizzato in situ e non invasivo dello sviluppo di biofilm e può essere ulteriormente sviluppata per associare l’imaging dello OCT a macrofotografia e alla profilatura dei microsensori.
Introduction
I biofilm sono un adattamento di stile di vita microbico di grande successo e queste comunità di microrganismi associate a matrici associate a matrici e associate a matrici dominano la vita microbica in ambienti naturali e industriali1,2. Lì, i biofilm formano architetture complesse, comegli streamer allungati 3, le increspature4 o i tappi simili a funghi5 con importanti conseguenze per la crescita del biofilm, la stabilità strutturale e la resistenza allo stress6. Mentre molto sulla differenziazione strutturale dei biofilm è stata appresa dal lavoro sulle culture monospecie coltivate in camere di flusso in miniatura, la maggior parte dei biofilm sono comunità altamente complesse, spesso compresi i membri di tutti i domini della vita6. Apprezzare questi complessi biofilm come paesaggi microbici7 e comprendere come la struttura e la funzione dei biofilm interagiscono in comunità complesse è quindi in prima linea nella ricerca sui biofilm.
Una comprensione meccanicistica della morfogenesi di biofilm complessi in risposta a segnali ambientali richiede esperimenti attentamente progettati in combinazione con osservazioni spaziali e temporali della struttura fisica dei biofilm attraverso bilance8. Tuttavia, l’osservazione non distruttiva della crescita di biofilm nei sistemi sperimentali è stata fortemente limitata da vincoli logistici come la necessità di spostare campioni (ad esempio, al microscopio) spesso danneggiando la delicata struttura del biofilm.
Il protocollo qui presentato introduce un sistema completamente automatizzato basato sulla tomografia a coerenza ottica (OCT), che consente il monitoraggio in situ e non invasivo della morfogenesi dei biofilm su scala mesoscala (gamma mm). L’OCT è una tecnica di imaging emergente nella ricerca sui biofilm con applicazioni nel trattamento delle acque e nella ricerca sul biofouling, medicina9 ed ecologia del flusso10. Nella PTOM, una sorgente di luce a bassa coerenza viene divisa in un campione e in un braccio di riferimento; viene analizzata l’interferenza della luce riflessa e dispersa dal biofilm (braccio campione) e la luce del braccio di riferimento. Una serie di profili di intensità assiale (A-scan) che contiene informazioni strutturali risolte in profondità viene acquisita e unita in un B-scan (una sezione trasversale). Una serie di B-scan adiacenti compone la scansione del volume 3D finale10. Il PToM fornisce una risoluzione ottica laterale nell’intervallo di circa 10 m ed è quindi adatto per studiare la differenziazione strutturale mesoscopica dei biofilm10,12. Per una descrizione più dettagliata dello Strumento di personalizzazione di Office, fare riferimento a Drexler e Fujimoto13e Fercher e colleghi14. Sebbene il campo visivo di una singola analisi xy dello Strumento di personalizzazione di Office raggiunga fino a centinaia di micrometri quadrati, i modelli su scala più grande non possono essere quantificati mediante lo Strumento di personalizzazione di Office in una singola analisi. Per quanto riguarda i biofilm in habitat naturali come corsi d’acqua e fiumi, questo attualmente limita la nostra capacità di valutare la morfogenesi del biofilm su scale corrispondenti al modello fisico e idraulico dell’habitat.
Per superare questi limiti spaziali e acquisire automaticamente le scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office, è stata montata una sonda di imaging dello OCT basata su un dominio spettrale su un sistema di posizionamento a 3 assi. L’installazione consente l’acquisizione di diverse scansioni OCT in un mosaico sovrapposto (taccature), ottenendo in modo efficace l’imaging tomografico di aree di superficie fino a 100 cm2. Inoltre, l’elevata precisione di posizionamento di questo sistema consente di monitorare in modo affidabile la crescita e lo sviluppo delle caratteristiche dei biofilm in siti specifici durante esperimenti a lungo termine. Il sistema è modulare e singoli componenti (ad esempio, dispositivo di posizionamento e OCT) dell’installazione possono essere utilizzati come soluzioni autonome o combinati in modo flessibile. Figura 1 fornisce una panoramica dei componenti hardware e hardware dell’installazione.
Il sistema è stato testato con un dispositivo di posizionamento CNC a supporto GRBL disponibile in commercio (Table of Materials). Le distanze di funzionamento di questa specifica piattaforma di posizionamento sono di 600-840-140 mm, con una precisione indicata dal produttore di 0,05 mm e una risoluzione programmabile di 0,005 mm. GRBL è un open-source (licenza GPLv3), un controllo del movimento ad alte prestazioni per CNC Dispositivi. Pertanto, ogni dispositivo di posizionamento basato su GRBL (versione > 1.1) deve essere compatibile con le linee guida e i pacchetti software qui presentati. Inoltre, il software potrebbe essere adattato ad altri controller stepmotor con tipo di ingresso STEP-DIR con poche modifiche.
Il dispositivo dello Strumento di personalizzazione di Office utilizzato per valutare le prestazioni del sistema (Tabella dei materiali) presenta una sorgente luminosa a bassa coerenza con una lunghezza d’onda centrale di 930 nm (larghezza di banda : 160 nm) e lunghezza e intensità del braccio di riferimento regolabili. Nell’esempio qui presentato è stato utilizzato anche un adattatore per l’immersione della sonda dello Strumento di personalizzazione di Office (Tabella dei materiali). Il pacchetto software sviluppato qui per l’acquisizione automatica dell’analisi dello Strumento di personalizzazione di Office dipende in modo critico dall’SDK fornito insieme al sistema dello Strumento di personalizzazione di Office specifico, tuttavia, i sistemi dello Strumento di personalizzazione di Office dello stesso produttore con lenti di scansione e lunghezze d’onda centrali diverse dovrebbero essere prontamente compatibile.
Il dispositivo GRBL è controllato da un server Web installato su un computer a scheda singola (Figura 1). Ciò garantisce il controllo remoto del dispositivo da qualsiasi computer con accesso a Internet o rete locale. Il dispositivo DELLO Strumento di personalizzazione di Office è controllato da un computer separato, consentendo il funzionamento del sistema OCT a parte la configurazione sperimentale automatizzata. Infine, i pacchetti software includono librerie per sincronizzare il posizionamento del probe dello Strumento di personalizzazione di Office e l’acquisizione dell’analisi dello Strumento di personalizzazione di Office (ad esempio, per acquisire automaticamente i set di dati di imaging 3D in un modello a mosaico o in un insieme di posizioni definite). La definizione della posizione della sonda OCT in 3D consente di regolare in modo efficace il piano focale in base a insiemi di scansioni (regionali). In particolare, su superfici non uniformi, è possibile specificare piani focali diversi (ad esempio, posizioni diverse nella direzione z) per ogni analisi dello Strumento di personalizzazione di Office.
È stato sviluppato un set di pacchetti softwareper elaborare le scansioni grezze dello Strumento di personalizzazione di Office (Tabella 1). Navigazione del dispositivo di posizionamento, l’acquisizione della scansione dello Strumento di personalizzazione di Office e l’elaborazione del set di dati vengono eseguite con notebook Jupyter con codifica Python, che consentono una notevole flessibilità nello sviluppo e nell’ottimizzazione del software. Due esempi lavorati e annotati di tali notebook (rispettivamente per l’acquisizione e l’elaborazione delle immagini) sono disponibili da https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git Essi sono da intendersi come punti di partenza per la personalizzazione del metodo. Un notebook Jupyter è un’applicazione basata su browser web che contiene celle con codice Python con annotato. Ogni passaggio è contenuto in una cella del blocco appunti, che può essere eseguita separatamente. A causa della diversa lunghezza del percorso della luce attraverso l’obiettivo di scansione (aberrazione sferica)15, le scansioni grezze dello Strumento di personalizzazione di Office appaiono distorte (Figura 2A). Abbiamo sviluppato un algoritmo per correggere automaticamente questa distorsione nelle scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office acquisite (contenute in ImageProcessing.ipynb, Supplementary File 1). Inoltre, la morfologia dei biofilm può essere visualizzata come una mappa di elevazione 2D, come è stato precedentemente utilizzato nei sistemi di membrana16, e illustriamo come le mappe di elevazione ottenute da scansioni prese in una matrice di afiltura possono essere cucite.
Infine, la funzionalità dell’installazione di laboratorio descritta viene illustrata utilizzando un esperimento a flume in cui il biofilm del flusso fototrofico è esposto a un gradiente di velocità del flusso.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’imaging dello OCT è adatto per risolvere le strutture nella gamma dei micrometri con un FOV di diversi millimetri quadrati. È quindi un potente strumento per la ricerca sui biofilm10,18. Tuttavia, lo OCT è attualmente limitato a un’area discansione massima di 100 – 256 mm 2, mentre i modelli strutturali dei biofilm spesso superano questa scala spaziale19, soprattutto quando la differenziazione morfologica è guidata da grad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Mauricio Aguirre Morales per il suo contributo allo sviluppo di questo sistema. Il sostegno finanziario è stato fornito dalla Fondazione nazionale svizzera per la scienza a T.J.B.
Materials
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
References
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).
- Flemming, H. -. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature reviews. Microbiology. 14, 563 (2016).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop. Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).
- Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Microbiology. 14, 251-263 (2016).
- Battin, T. J., et al. Microbial landscapes: new paths to biofilm research. Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).
- Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm. J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002 (2016).
- Wagner, M., Horn, H. Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review. Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
- Haisch, C., Niessner, R. Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography. Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. . Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , (2008).
- Fercher, A. F. Optical coherence tomography – development, principles, applications. Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).
- Lee, H. -. C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy. Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).
- Fortunato, L., Leiknes, T. In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping. Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).
- Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).
- Roche, K. R., et al. Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams. Water Resources. 53, 222-236 (2016).
- Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor. Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).
