大規模な空間スケールでバイオフィルムの形態形成を解明する自動化された3D光コヘレンス断層撮影
Summary
微生物バイオフィルムは、相間で複雑なアーキテクチャを形成し、高度にスケール依存する空間パターンに発展します。ここでは、3D光コヘレンス断層撮影(OCT)データセットの自動取得のための実験システム(ハードおよびソフトウェア)を紹介する。このツールセットは、空間と時間におけるバイオフィルム形態形成の非侵襲的かつ多スケールの特性を可能にする。
Abstract
バイオフィルムは、最も成功した微生物のライフスタイルであり、環境とエンジニアリングされた設定の多くで普及しています。バイオフィルムの形態形成を理解することは、コミュニティ集会におけるバイオフィルムの構造的多様化であり、空間的および時間的スケールを越えた顕著な課題を表しています。ここでは、光コヘレンス断層撮影(OCT)に基づく自動バイオフィルムイメージングシステムを紹介する。OCTは、バイオフィルム研究における新しいイメージング技術です。しかし、現在取得および処理できるデータの量は、バイオフィルム形態における大規模なパターンの統計的推論を妨げる。自動化されたOCTイメージ投射システムはバイオフィルムの成長の大きい空間および拡張された時間的スケールをカバーすることを可能にする。市販のOCTシステムとロボット測位プラットフォーム、およびOCTスキャンプローブの位置を制御するソフトウェアソリューションのスイート、および3Dバイオフィルムイメージングデータセットの取得と処理を組み合わせたものです。このセットアップにより、バイオフィルム開発のオンサイトおよび非侵襲的な自動モニタリングが可能になり、OCTイメージングとマクロ撮影およびマイクロセンサープロファイリングを組み合わせてさらに開発することができます。
Introduction
バイオフィルムは、非常に成功した微生物のライフスタイル適応であり、微生物のこれらの相間関連およびマトリックス囲まれたコミュニティは、自然および産業の設定1、2で微生物の生命を支配する。そこで、バイオフィルムは、細長いストリーマー3、波紋4またはキノコのようなキャップ5などの複雑なアーキテクチャを形成し、バイオフィルムの成長、構造安定性および応力6に対する耐性に重要な結果をもたらす。バイオフィルムの構造的分化に関する多くは、ミニチュアフローチャンバーで栽培された単一種培養に関する研究から学びましたが、ほとんどのバイオフィルムは、多くの場合、生命6のすべてのドメインのメンバーを含む非常に複雑なコミュニティです。これらの複雑なバイオフィルムを微生物の景観7として鑑賞し、複雑なコミュニティにおけるバイオフィルムの構造と機能がどのように相互作用するかを理解することは、バイオフィルム研究の最前線にあります。
環境的手がかりに応じて複雑なバイオフィルムの形態形成を機械的に理解するには、関連するバイオフィルム物理構造の空間的および時間的に解決された観察と組み合わせて慎重に設計された実験が必要です。スケール8.しかしながら、実験システムにおけるバイオフィルムの成長の非破壊観察は、繊細なバイオフィルム構造を損傷することが多いサンプル(例えば、顕微鏡)を移動する必要性などのロジスティック制約によって厳しく制限されている。
ここで提示されるプロトコルは、光学コヘレンス断層撮影(OCT)に基づく完全に自動化されたシステムを導入し、メソスケール(mm範囲)でのバイオフィルム形態形成の非侵襲的なモニタリングを可能にする。OCTは、水処理およびバイオファウリング研究、医学9およびストリーム生態学10の応用を伴うバイオフィルム研究における新しいイメージング技術である。OCTでは、低コハサイレンス光源がサンプルアームとリファレンスアームに分割されます。バイオフィルム(サンプルアーム)とリファレンスアームの光によって反射され散乱する光の干渉を解析します。深度解決構造情報を含む一連の軸強度プロファイル(A-ss)が取得され、Bスキャン(断面)にマージされます。一連の隣接する B スキャンは、最終的な 3D ボリューム スキャン10を構成します。OCTは、約10μmの範囲で横光学分解能を提供し、したがって、バイオフィルム10、12のメソスコピック構造分化を研究するのに適しています。OCTの詳細については、ドレクスラーと藤本13とファーチャーと同僚14を参照してください。1つのOCT xyスキャンの視野は数百平方マイクロメートルに達するが、より大きいスケールパターンは1回のスキャンでOCTによって定量することはできない。河川や河川などの自然生息地におけるバイオフィルムに関しては、現在、生息地の物理的および油圧テンプレートに一致するスケールでバイオフィルム形態形成を評価する能力が制限されています。
これらの空間的限界を超え、OCTスキャンを自動的に取得するために、スペクトルドメインOCTイメージングプローブを3軸測位システムに搭載しました。このインストールにより、重なり合うモザイクパターン(タイルスキャン)で複数のOCTスキャンを取得することができ、100 cm2までの表面積の断層撮影を効果的に達成します。さらに、このシステムの高い位置決め精度は、長期実験中に特定の部位におけるバイオフィルム機能の成長と発展を確実に監視することを可能にする。システムは、モジュラーおよび個々のコンポーネント(すなわち、位置決め装置およびOCT)をスタンドアロンソリューションとして使用するか、または柔軟に組み合わせることができる。図 1は、インストールのハード コンポーネントとソフトウェア コンポーネントの概要を説明します。
システムは市販のGRBL制御CNC測位装置(材料のテーブル)によってテストされた。この特定の位置のプラットホームの作動距離は600×840×140のmm、+/- 0.05 mmの製造業者指定の正確さおよび0.005のmmのプログラム可能な決断はオープンソース(GPLv3ライセンス)、CNCのための高性能の動き制御であるデバイス。したがって、すべての GRBL ベース (バージョン > 1.1) 測位デバイスは、ここに示すガイドラインおよびソフトウェア パッケージと互換性がある必要があります。さらに、ソフトウェアは、いくつかの変更でSTEP-DIR入力タイプを持つ他のステップモータコントローラに適応することができます。
システムの性能を評価するために使用されるOCT装置(材料の表)は930 nm(帯域幅=160 nm)および調節可能な参照腕の長さおよび強度の中心波長の低コハサイレンス光源を特色にする。ここで示す例では、OCTプローブを流れる水に浸すための浸漬アダプターも使用した(材料の表)。自動OCTスキャン集録のためにここで開発されたソフトウェアパッケージは、特定のOCTシステムと一緒に提供されるSDKに大きく依存しますが、異なるスキャンレンズと中央波長を持つ同じメーカーのOCTシステムは、容易に互換性があります。
GRBL デバイスは、シングルボード コンピュータにインストールされている Web サーバーによって制御されます (図1)。これにより、ローカル ネットワークまたはインターネット アクセスを持つ任意のコンピュータからデバイスのリモート 制御が許可されます。OCTデバイスは別のコンピュータによって制御され、自動実験セットアップを除いてOCTシステムの動作を可能にします。最後に、ソフトウェアパッケージには、OCTプローブの位置決めとOCTスキャン集録を同期するライブラリ(すなわち、モザイクパターンまたは定義された位置のセットで3Dイメージングデータセットを自動的に取得する)が含まれます。OCTプローブの位置を3Dで効果的に定義すると、(地域的な)スキャンセット専用の焦点面を効果的に調整できます。具体的には、不均一な表面では、各OCTスキャンに対して異なる焦点面(すなわち、z方向の異なる位置)を指定することができる。
生のOCTスキャンを処理するために一連のソフトウェアパッケージが開発されました(表1)。測位デバイスのナビゲーション、OCTスキャン取得、データセット処理はPythonコード化されたJupyterノートブックで行われ、ソフトウェアの開発と最適化に非常に柔軟性があります。このようなノートブックの2つの作業と注記の例(それぞれ画像の取得と処理のために)は、https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.gitから入手可能です彼らはカスタマイズの出発点として意図されていますメソッドの。Jupyter ノートブックは、Python コードに付いたセルを含む Web ブラウザベースのアプリケーションです。各ステップはノートブックのセルに含まれており、個別に実行できます。スキャンレンズを通る光経路の長さが異なるため(球面収差)15は、生のOCTスキャンが歪んで見える(図2A)。取得したOCTスキャン(ImageProcessing.ipynb、補足ファイル1に含まれる)でこの歪みを自動的に補正するアルゴリズムを開発しました。さらに、バイオフィルム形態は、膜システム16で以前に使用されていたように、2D標高マップとして視覚化することができ、タイリングアレイで撮影したスキャンから得られた標高マップをステッチする方法を示す。
最後に、説明された実験室設置の機能性は、光栄養流れバイオフィルムが流速の勾配にさらされるフルーム実験を用いて示される。
Protocol
Representative Results
Discussion
OCTイメージングは、数平方ミリメートルのFOVを持つマイクロメータ範囲の構造を解決するのに適しています。したがって、バイオフィルム研究10、18のための強力なツールです。しかし、OCTは現在、最大スキャン面積100~256mm2に制限されていますが、バイオフィルム構造パターンは、特に大規模な環境勾配によって形態学的分化が駆動される?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、マウリシオ・アギーレ・モラレスがこのシステムの開発に貢献してくれたことに感謝する。 財政支援はスイス国立科学財団からT.J.B.に寄付されました。
Materials
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
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