대규모 공간 스케일을 통해 생물막 형태 형성을 해명하는 자동화된 3D 광학 일관성 단층 촬영
Summary
미생물 생물막은 서로 복잡한 구조를 형성하고 매우 규모에 의존하는 공간 패턴으로 발전합니다. 여기에서는 3D 광학 일관성 단층 촬영(OCT) 데이터 세트를 자동으로 수집하기 위한 실험 시스템(하드 및 소프트웨어)을 소개합니다. 이 도구 세트는 공간과 시간에 생물막 형태 형성의 비침습적 및 다중 스케일 특성화를 허용합니다.
Abstract
바이오필름은 가장 성공적인 미생물 라이프스타일이며 다양한 환경 및 엔지니어링 환경에서 우세합니다. 공동체 조립 중에 생물막의 구조적 다각화인 생물막 형태 형성을 이해하는 것은 공간적 및 시간적 비늘 전반에 걸친 놀라운 도전과제입니다. 여기에서, 우리는 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)에 근거를 둔 자동화한 생물막 화상 진찰 시스템을 제시합니다. OCT는 생물막 연구에서 새롭게 떠오르는 이미징 기술입니다. 그러나 현재 획득 및 처리할 수 있는 데이터의 양은 생물막 형태학에서 대규모 패턴의 통계적 추론을 방해합니다. 자동화된 OCT 이미징 시스템은 생물막 성장의 큰 공간 및 확장된 시간적 스케일을 커버할 수 있게 합니다. 시판되는 OCT 시스템과 로봇 포지셔닝 플랫폼 및 소프트웨어 솔루션 제품군을 결합하여 OCT 스캐닝 프로브의 위치 지정과 3D 생물막 이미징 데이터 세트의 수집 및 처리를 제어합니다. 이 설정은 생물막 개발의 현장 및 비침습적 자동화 모니터링을 허용하며, 매크로 사진 및 마이크로센서 프로파일링과 OCT 이미징을 결합하기 위해 추가로 개발될 수 있습니다.
Introduction
생물막은 매우 성공적인 미생물 라이프 스타일 적응이며, 이러한 상간 관련 미생물의 매트릭스 동봉 된 지역사회는 자연 및 산업 설정에서 미생물 의 삶을 지배 1,2. 거기서, 생물막은 길쭉한 스트리머 3,리플4 또는 버섯형 캡5와 같은 복잡한 구조를 형성하며 생물막 성장, 구조적 안정성 및스트레스에대한 저항성 6. 생물막 구조화에 관한 많은 것들이 미니어처 플로우 챔버에서 자란 모노종 문화에 대한 작업에서 배웠지만, 대부분의 생물막은 종종 생명의 모든 영역의 구성원을 포함하는 매우 복잡한 공동체이다6. 이러한 복잡한 생물막을 미생물 풍경 7로 이해하고 복잡한 지역 사회에서 생물막 구조와 기능이 어떻게 상호 작용하는지 이해하는 것이 생물막 연구의 최전선에 있습니다.
환경 단서에 반응하여 복잡한 생물막의 형태 형성에 대한 기계적 이해는 관련 에 걸쳐 생물막 물리적 구조의 공간적 및 시간적으로 해결 된 관찰과 함께 신중하게 설계된 실험을 필요로합니다. 저울8. 그러나, 실험 시스템에서 생물막 성장의 비파괴적 관찰은 섬세한 생물막 구조를 손상시키는 시료(예를 들어, 현미경)를 이동시킬 필요성과 같은 물류 제약에 의해 심각하게 제한되고 있다.
여기에 제시된 프로토콜은 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)에 기초한 완전 자동화 된 시스템을 소개하며, 이는 메조 스케일 (mm 범위)에서 생물막 형태 형성의 현장, 비 침습적 모니터링을 허용합니다. OCT는 수처리 및 바이오폴링 연구, 의학9 및 스트림 생태학10에응용된 생물막 연구에서 새로운 이미징 기술입니다. OCT에서, 낮은 일관성 광원은 샘플 및 참조 암으로 분할된다; 생물막(샘플 암)에 의해 반사되고 산란된 빛의 간섭과 기준 암의 빛을 분석한다. 깊이 해결된 구조 정보가 포함된 일련의 축 강도 프로파일(A-스캔)을 획득하여 B 스캔(단면)으로 병합합니다. 일련의 인접한 B-스캔은 최종 3D 볼륨 스캔10을구성합니다. OCT는 약 10 μm의 범위에서 측면 광학 분해능을 제공하므로 생물막10,12의중피 구조적 분화를 연구하는 데 적합합니다. OCT에 대한 자세한 설명은 드렉슬러와 후지모토13,퍼처 및 동료14를참조하십시오. 단일 OCT xy-scan의 시야가 수백 평방 마이크로미터에 도달하지만 단일 스캔에서 OCT를 통해 대규모 패턴을 정량화할 수 없습니다. 하천과 같은 자연 서식지의 생물막과 관련하여, 현재 는 서식지의 물리적 및 유압 템플릿과 일치하는 스케일에서 생물막 형태 형성을 평가하는 능력을 제한합니다.
이러한 공간 한계를 뛰어넘고 OCT 스캔을 자동으로 획득하기 위해 스펙트럼 도메인 OCT 이미징 프로브를 3축 포지셔닝 시스템에 장착했습니다. 설치는 중첩 모자이크 패턴 (타일 스캔)에서 여러 OCT 스캔을 수집하여 최대 100cm 2까지 표면적의 단장 촬영 이미징을 효과적으로 달성 할 수 있습니다. 또한, 이 시스템의 높은 포지셔닝 정밀도를 통해 장기 실험 중에 특정 부위의 생물막 기능의 성장과 개발을 안정적으로 모니터링할 수 있습니다. 이 시스템은 모듈식이며 설치의 개별 구성 요소(즉, 위치 지정 장치 및 OCT)는 독립형 솔루션으로 사용하거나 유연하게 결합할 수 있습니다. 그림 1은 설치의 하드 및 소프트웨어 구성 요소에 대한 개요를 제공합니다.
이 시스템은 시판되는 GRBL 제어 CNC 포지셔닝 장치(재료 표)로 시험하였다. 이 특정 포지셔닝 플랫폼의 작동 거리는 600×840×140mm이며, 제조업체가 표시한 정확도 +/- 0.05 mm, 프로그래밍 가능한 해상도0.005mm. GRBL은 CNC용 오픈 소스(GPLv3 License), 고성능 모션 컨트롤입니다. 장치. 따라서 모든 GRBL 기반(버전 > 1.1) 포지셔닝 장치는 여기에 제시된 지침 및 소프트웨어 패키지와 호환되어야 합니다. 또한, 소프트웨어는 몇 가지 수정과 STEP-DIR 입력 유형과 다른 스텝 모터 컨트롤러에 적응 할 수있다.
시스템의 성능을 평가하는 데 사용되는 OCT장치(재료 표)는 중심 파장이 930nm(대역폭 = 160nm)의 낮은 일관성 광원을 특징으로 하며, 조정 가능한 기준 암 길이 및 강도가 있습니다. 여기에 제시된 예에서, OCT 프로브를 흐르는 물에 담그는 침지 어댑터(표오브 머티리얼)도사용되었다. 자동화된 OCT 스캔 수집을 위해 여기에서 개발된 소프트웨어 패키지는 특정 OCT 시스템과 함께 제공되는 SDK에 따라 크게 달라지지만, 다른 스캔 렌즈와 중앙 파장이 있는 동일한 제조업체의 OCT 시스템은 쉽게 호환됩니다.
GRBL 장치는 단일 보드 컴퓨터에 설치된 웹 서버에 의해제어됩니다(그림 1). 이렇게 하면 로컬 네트워크 또는 인터넷 액세스가 있는 모든 컴퓨터에서 장치를 원격으로 제어할 수 있습니다. OCT 장치는 별도의 컴퓨터에 의해 제어되므로 자동화된 실험 설정을 제외하고 OCT 시스템의 작동이 가능합니다. 마지막으로, 소프트웨어 패키지에는 OCT 프로브 포지셔닝 및 OCT 스캔 수집을 동기화하는 라이브러리가 포함됩니다(즉, 모자이크 패턴 또는 정의된 위치 집합에서 3D 이미징 데이터 세트를 자동으로 수집하기 위해). OCT 프로브의 위치를 3D로 효과적으로 정의하면 (지역) 스캔 세트에 맞게 초점 평면을 조정할 수 있습니다. 특히 고르지 않은 표면에서 각 OCT 스캔에 대해 서로 다른 초점 평면(즉, z 방향으로 다른 위치)을 지정할 수 있습니다.
원시 OCT 스캔을 처리하기 위해 소프트웨어 패키지집합이 개발되었습니다(표 1). 포지셔닝 디바이스의 탐색, OCT 스캔 수집 및 데이터 세트 처리는 파이썬 코딩 된 Jupyter 노트북으로 수행되어 소프트웨어의 개발 및 최적화에 있어 뛰어난 유연성을 제공합니다. 이러한 노트북의 두 가지 작업 및 추가 된 예제 (이미지 수집 및 처리에 대 한) 사용할 수 https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git 그들은 사용자 지정에 대 한 시작 점으로 의도 메서드의. Jupyter 노트북은 추가 된 파이썬 코드가있는 셀을 포함하는 웹 브라우저 기반 응용 프로그램입니다. 각 단계는 노트북의 셀에 포함되어 있으며, 별도로 실행할 수 있습니다. 스캔 렌즈(구면 수차)(15)를 통해 광 경로의길이가 상이하기 때문에, 원시 OCT 스캔이 왜곡된 것처럼 보인다(도2A). 우리는 획득 한 OCT 스캔에서이 왜곡을 자동으로 수정하는 알고리즘을 개발했습니다 (ImageProcessing.ipynb, 보충 파일1). 또한, 생물막 형태는 이전에 멤브레인 시스템16에서사용되었던 것처럼 2D 고도 맵으로 시각화될 수 있으며, 타일링 배열에서 가져온 스캔에서 얻은 고도 맵이 어떻게 스티치될 수 있는지 설명합니다.
마지막으로, 설명된 실험실 설치의 기능은 광영양 스트림 생물막이 유속의 구배에 노출되는 수로 실험을 사용하여 설명됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT 이미징은 수 제곱 밀리미터의 FOV로 마이크로미터 범위의 구조를 해결하는 데 적합합니다. 따라서 생물막 연구를 위한 강력한 도구10,18. 그러나 OCT는 현재 최대 스캔 면적이 100- 256 mm2로 제한되어 있으며, 생물막 구조 패턴은 종종 이 공간 스케일19를초과하는 반면, 특히 형태학적 차별화가 대규모 환경 그라데이션에 의해 구동되는 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
마우리시오 아구에르 모랄레스가 이 시스템 개발에 기여한 것에 대해 감사드립니다. 재정 지원은 스위스 국립 과학 재단에서 T.J.B에 왔습니다.
Materials
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
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