Автоматизированная 3D оптическая когеренционная томография для выяснения биофильма Morphogenesis над большими пространственными весами
Summary
Микробные биопленки образуют сложные архитектуры на межфазах и превращаются в сильно зависящие от масштаба пространственные узоры. Здесь мы внедряем экспериментальную систему (жесткое и программное обеспечение) для автоматизированного приобретения наборов 3D оптической когересцены (OCT). Этот набор инструментов позволяет неинвазивную и многомасштабную характеристику биопленки морфогенеза в пространстве и времени.
Abstract
Биопленки являются наиболее успешным микробным образом жизни и преобладают во множестве экологических и инженерных настройки. Понимание морфогенеза биопленки, то есть структурной диверсификации биопленок во время собрания сообщества, представляет собой замечательную проблему в пространственных и временных масштабах. Здесь мы представляем автоматизированную систему визуализации биопленки на основе оптической когеренционной томографии (ОКТ). OCT является новой техникой визуализации в исследованиях биопленки. Однако объем данных, которые в настоящее время могут быть получены и обработаны, препятствует статистическому выводу о крупномасштабных закономерностях в морфологии биопленки. Автоматизированная система визуализации OCT позволяет покрывать большие пространственные и расширенные временные масштабы роста биопленки. Он сочетает в себе коммерчески доступную систему OCT с роботизированной платформой позиционирования и набором программных решений для управления позиционированием сканирования зонда OCT, а также приобретением и обработкой наборов данных для визуализации 3D биопленки. Эта установка позволяет in situ и неинвазивный автоматизированный мониторинг развития биопленки и может быть дополнительно разработан для сочетания OCT изображений с макрофотографией и микросенсорным профилированием.
Introduction
Биопленки являются весьма успешной адаптации микробного образа жизни и эти межфазные и матричные закрытые сообщества микроорганизмов доминируют микробной жизни в естественных и промышленных условиях1,2. Там, биопленки образуют сложные архитектуры, такие как удлиненные растяжки3, рябь4 или грибоподобные колпачки5 с важными последствиями для роста биопленки, структурной стабильности и устойчивости к стрессу6. Хотя многое о биопленки структурной дифференциации было извлечено из работы по моновидовкультуры, выращенные в миниатюрных камер потока, большинство биофильмов очень сложных общин часто в том числе членов всех областях жизни6. Оценивая эти сложные биопленки как микробные ландшафты7 и понимание того, как структура и функция биопленки взаимодействуют в сложных сообществах, таким образом, находится на переднем крае исследований биопленки.
Механистическое понимание морфогенеза сложных биопленок в ответ на экологические сигналы требует тщательно разработанных экспериментов в сочетании с пространственно и временно решенными наблюдениями биопленки физической структуры по всей актуальности весы8. Однако неразрушающие наблюдения за ростом биопленки в экспериментальных системах были серьезно ограничены такими логистическими ограничениями, как необходимость перемещения образцов (например, в микроскоп), часто повреждающих тонкую структуру биопленки.
Представленный здесь протокол вводит полностью автоматизированную систему, основанную на оптической когеренционной томографии (ОКТ), которая позволяет вести неинвазивный мониторинг биопленогенеза в мезомасштабе (мм диапазоне). OCT является новой техникой визуализации в биопленки исследований с приложениями в области очистки воды и биофоллинг исследований, медицины9 и потока экологии10. В OCT источник света с низкой согласованностью делится на образец и эталонную руку; анализируется интерференция света, отраженного и рассеянного биопленкой (образец руки), и свет эталонной руки. Серия профилей интенсивности осевой нагрузки (A-scans), которая содержит глубоко решенную структурную информацию, приобретается и сливается в B-сканирование (сечение). Серия смежных B-сканов составляет окончательный 3D объем сканирования10. OCT обеспечивает боковое оптическое разрешение в диапазоне около 10 мкм и поэтому хорошо подходит для изучения мезоскопической структурной дифференциации биопленок10,12. Для более подробного описания OCT, обратитесь к Drexler и Fujimoto13и Ферчер и коллеги14. Хотя поле зрения одного OCT xy-scan достигает сотен квадратных микрометров, более крупные модели не могут быть количественно оценены с помощью OCT в одном сканировании. Что касается биопленки в естественных средах обитания, таких как ручьи и реки, это в настоящее время ограничивает нашу способность оценивать биопленки морфогенеза в масштабах, соответствующих физическому и гидравлическому шаблону среды обитания.
Для того, чтобы превзойти эти пространственные пределы и автоматически приобрести ОКТ сканирование, спектральный домен OCT imaging зонд был установлен на 3-осевой системы позиционирования. Установка позволяет получить несколько OCT сканирования в перекрывающихся мозаики картины (плитка сканирования), эффективно достижения томографической визуализации поверхностных участков до 100 см2. Кроме того, высокая точность позиционирования этой системы позволяет надежно контролировать рост и развитие функций биопленки на конкретных участках во время длительных экспериментов. Система является модульной и отдельные компоненты (наоборот, позиционирование устройства и OCT) установки могут быть использованы в качестве автономных решений или гибко сочетаются. Рисунок 1 предоставляет обзор жестких и программных компонентов установки.
Система была протестирована с коммерчески доступным GRBL-контролируемым устройством позиционирования CNC(Таблицаматериалов). Рабочие расстояния этой конкретной платформы позиционирования составляют 600-840-140 мм, с указанной производителем точностью 0,05 мм и программируемым разрешением 0,005 мм. GRBL является открытым исходным кодом (лицензия GPLv3), высокопроизводительным управлением движением для CNC Устройств. Таким образом, каждый GRBL основе (версия Nogt; 1.1) позиционирование устройство должно быть совместимо с руководящими принципами и пакетами программного обеспечения, представленных здесь. Кроме того, программное обеспечение может быть адаптировано к другим stepmotor контроллеров с STEP-DIR ввода типа с несколькими изменениями.
Устройство OCT, используемое для оценки производительности системы(Таблица материалов) имеет низкий источник слаженный свет с центральной длиной волны 930 нм (ширина пропускания 160 нм) и регулируемой длиной и интенсивностью эталонной руки. В приведенном здесь примере также использовался адаптер погружения для погружения зонда OCT в протекающую воду(ТаблицаМатериалов). Программное обеспечение пакет, разработанный здесь для автоматизированного приобретения сканирования ОКТ критически зависит от SDK, предоставляемых вместе с конкретной системой OCT, однако, OCT систем ы от того же производителя с различными сканирования линз и центральной длины волн должны быть легко совместимы.
Устройство GRBL управляется веб-сервером, установленным на однобортном компьютере(рисунок 1). Это предоставляет пульт дистанционного управления устройством с любого компьютера с локальной сетью или доступом в Интернет. Устройство OCT управляется отдельным компьютером, что позволяет работать с системой OCT в сторону автоматизированной экспериментальной настройки. Наконец, пакеты программного обеспечения включают библиотеки для синхронизации позиционирования зонда OCT и приобретения сканирования OCT (т.е. для автоматического приобретения наборов данных 3D-изображений в мозаичном шаблоне или в наборе определенных позиций). Определение положения зонда OCT в 3D эффективно позволяет настроить фокусную плоскость специально для (региональных) наборов сканирований. В частности, на неровных поверхностях для каждого сканирования OCT могут быть указаны различные фокусные плоскости (т.е. различные положения в направлении z).
Набор программных пакетов был разработан для обработки необработанных ОКТ-сканирований(таблица 1). Навигация устройства позиционирования, приобретение сканирования OCT и обработка наборов данных выполняются с помощью ноутбуков Jupyter с кодовым кодом Python, которые обеспечивают замечательную гибкость в разработке и оптимизации программного обеспечения. Два отработанных и аннотированных примера таких тетрадей (для приобретения изображений и обработки, соответственно) доступны из https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git Они предназначены в качестве отправных точек для настройки метода. Ноутбук Jupyter — это приложение на основе веб-браузера, которое содержит ячейки с аннотированным кодом Python. Каждый шаг содержится в ячейке блокнота, который может быть выполнен отдельно. Из-за разной длины светового пути через скан-объектив (сферическая аберрация)15, сырые сканирование OCT появляются искаженными(рисунок 2A). Мы разработали алгоритм для автоматического исправления этого искажения в приобретенных OCT сканирования (содержится в ImageProcessing.ipynb, Дополнительный файл 1). Кроме того, биопленка морфологии может быть визуализирована как 2D карта высоты, как это было ранее используется в мембранных систем16, и мы иллюстрируем, как высота карты, полученные от сканирования, принятых в плиточный массив могут быть сшиты.
Наконец, функциональность описанной лабораторной установки иллюстрируется с помощью эксперимента с флеймом, в котором биопленка фототрофического потока подвергается градиенту скорости потока.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oct изображение хорошо подходит для решения структур в диапазоне микрометров с FOV в несколько квадратных миллиметров. Таким образом, это мощный инструмент для исследования биопленки10,18. Тем не менее, OCT в настоящее время ограничивается максимальной площад…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Маурисио Агирре Моралеса за его вклад в развитие этой системы. Финансовая поддержка была получена от Швейцарского национального научного фонда t.J.B.
Materials
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
References
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).
- Flemming, H. -. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature reviews. Microbiology. 14, 563 (2016).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop. Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).
- Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Microbiology. 14, 251-263 (2016).
- Battin, T. J., et al. Microbial landscapes: new paths to biofilm research. Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).
- Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm. J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002 (2016).
- Wagner, M., Horn, H. Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review. Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
- Haisch, C., Niessner, R. Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography. Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. . Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , (2008).
- Fercher, A. F. Optical coherence tomography – development, principles, applications. Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).
- Lee, H. -. C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy. Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).
- Fortunato, L., Leiknes, T. In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping. Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).
- Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).
- Roche, K. R., et al. Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams. Water Resources. 53, 222-236 (2016).
- Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor. Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).
