Automatiserad 3D optisk koherens tomografi för att belysa biofilm morfogenes över stora rumsliga skalor
Summary
Mikrobiella biofilmer bildar komplexa arkitekturer på interfaser och utvecklas till mycket skala beroende rumsliga mönster. Här introducerar vi ett experimentellt system (hård-och programvara) för automatiserad förvärv av 3D optisk konsekvens tomografi (OCT) DataSet. Denna verktygslåda möjliggör icke-invasiv och flerskalig karakterisering av biofilm morfogenes i tid och rum.
Abstract
Biofilmer är en mycket framgångsrik mikrobiell livsstil och råder i en mängd miljö-och konstruerade miljöer. Förstå biofilm morphogenesis, det är den strukturella diversifiering av biofilmer under gemenskapens församling, utgör en anmärkningsvärd utmaning över rumsliga och temporala skalor. Här presenterar vi en automatiserad biofilm Imaging system baserat på optisk koherens tomografi (ULT). OCT är en framväxande bildteknik i biofilm forskning. Men den mängd data som för närvarande kan förvärvas och bearbetas hämmar Statistisk inferens av storskaliga mönster i biofilm morfologi. Den automatiserade OCT Imaging system kan täcka stora rumsliga och utökade tidsmässiga skalor av biofilm tillväxt. Den kombinerar en kommersiellt tillgänglig OCT-system med en robotstyrd positionerings plattform och en svit av mjukvarulösningar för att styra placeringen av OCT skanning sond, samt förvärv och bearbetning av 3D biofilm Imaging DataSet. Denna inställning tillåter in situ och icke-invasiv automatiserad övervakning av biofilms utveckling och kan vidareutvecklas för att par okt Imaging med makrofotografering och MicroSensor profilering.
Introduction
Biofilmer är en mycket framgångsrik mikrobiell livsstil anpassning och dessa Interphase-associerade och Matrix-slutna samhällen av mikroorganismer dominerar mikrobiella livet i naturliga och industriella inställningar1,2. Där bildar biofilmer komplexa arkitekturer, såsom långsträckta streamers3, krusningar4 eller svampliknande CAPS5 med viktiga konsekvenser för biofilmer tillväxt, strukturell stabilitet och motståndskraft mot stress6. Medan mycket om biofilm strukturell differentiering har lärt sig från arbetet med mono-arter kulturer odlas i miniatyr flöde kammare, de flesta biofilmer är mycket komplexa samhällen ofta inklusive medlemmar av alla områden i livet6. Uppskattar dessa komplexa biofilmer som mikrobiell landskap7 och förstå hur biofilm struktur och funktion samverkar i komplexa samhällen är därför i spetsen för biofilm forskning.
En mekanistisk förståelse av morfogenes av komplexa biofilmer som svar på miljömässiga signaler kräver noggrant utformade experiment i samband med rumsligt och temporalt lösta observationer av biofilm fysisk struktur över relevanta skalor8. Den oförstörande iakttagelsen av biofilms tillväxt i experimentella system har dock kraftigt begränsats av logistiska begränsningar såsom behovet av att flytta prover (t. ex. till ett Mikroskop) som ofta skadar den känsliga bio film strukturen.
Det protokoll som presenteras här introducerar ett helt automatiserat system baserat på optisk koherens tomografi (ULT), som möjliggör in situ, icke-invasiv övervakning av biofilm morfogenes i mesoskalig (mm-området). Oct är en framväxande bildteknik i biofilm forskning med tillämpningar inom vattenrening och påväxt forskning, medicin9 och Stream ekologi10. I ULT är en låg samstämmighet ljuskälla uppdelad i ett prov och referens arm; störningen av det ljust reflekterat och skingrat av biofilmen (ta prov beväpnar), och det ljust av hänvisa till beväpnar analyseras. En serie axiella intensitetsprofiler (A-skanningar) som innehåller djuplösta strukturella uppgifter förvärvas och slås samman till en B-Scan (ett tvärsnitt). En serie intilliggande B-skanningar komponerar den slutliga 3D-volymskanningen10. ULT ger en lateral optisk upplösning i intervallet cirka 10 μm och är därför väl lämpad att studera Mesoskopisk strukturell differentiering av biofilmer10,12. För en mer detaljerad beskrivning av ULT, se Drexler och Fujimoto13och fercher och kollegor14. Även om synfält av en enda OCT XY-Scan når upp till hundratals kvadratiska mikrometrar, kan större skala mönster inte kvantifieras med hjälp av ULT i en enda genomsökning. När det gäller biofilmer i naturliga livsmiljöer såsom bäckar och floder, detta begränsar för närvarande vår förmåga att bedöma biofilm morfogenes i skalor som matchar den fysiska och hydrauliska mall av livsmiljön.
För att överträffa dessa rumsliga gränser och att förvärva OCT skannar automatiskt, en spektral-domän OCT Imaging sond var monterad på en 3-axlig positioneringssystem. Installationen tillåter förvärv av flera Oct skannar i ett överlappande mosaikmönster (kakel skanning), effektivt uppnå tomografiska tycks Imaging av ytan områden upp till 100 cm2. Dessutom möjliggör den höga positionerings precisionen hos detta system att på ett tillförlitligt sätt övervaka tillväxten och utvecklingen av bio Films funktioner på specifika platser under långvariga experiment. Systemet är moduluppbyggda och enskilda komponenter (dvs positionerings enhet och Oct) av anläggningen kan användas som fristående lösningar eller flexibelt kombinerade. Figur 1 ger en översikt över de hård-och programvarukomponenter som finns i installationen.
Systemet testades med en kommersiellt tillgänglig GRBL-styrd CNC-positioneringsenhet (tabell över material). Drifts avståndet för denna specifika positionerings plattform är 600 × 840 × 140 mm, med en tillverkarspecifik noggrannhet på +/-0,05 mm och en programmerbar upplösning på 0,005 mm. GRBL är en öppen källkod (GPLv3 License), högpresterande Motion Control för CNC- Enheter. Därför bör varje GRBL-baserad (version > 1,1) positioneringsenhet vara kompatibel med de riktlinjer och programvarupaket som presenteras här. Dessutom kan programvaran anpassas till andra stepmotor Controller med STEP-DIR input typ med några ändringar.
Den ULT-enhet som används för att bedöma systemets prestanda (tabell över material) har en låg samstämmighet ljuskälla med en mittvåglängd på 930 nm (bandbredd = 160 Nm) och justerbar referens arm längd och intensitet. I det exempel som presenteras här, en Immersion adapter för doppning av OCT sonden i strömmande vatten användes också (tabell över material). Den programvara som utvecklats här för automatiserad OCT Scan förvärvet kritiskt beror på SDK som tillsammans med den specifika ULT-systemet, dock, ULT system från samma tillverkare med olika Scan linser och centrala våglängder bör vara lätt kompatibel.
GRBL-enheten styrs av en webbserver som är installerad på en enda dator (bild 1). Detta ger fjärrstyrning av enheten från vilken dator som helst med lokalt nätverk eller Internetåtkomst. ULT enheten styrs av en separat dator, vilket gör att driften av ULT systemet undan den automatiserade experimentella installationen. Slutligen programvarupaketen inkluderar bibliotek för att synkronisera OCT PROBE positionering och OCT Scan förvärv (dvs. att automatiskt förvärva 3D Imaging dataset i en mosaikmönster eller i en uppsättning av definierade positioner). Definiera positionen för OCT sonden i 3D effektivt gör det möjligt att justera fokalplanet specifikt för (regionala) uppsättningar av skanningar. Specifikt, på ojämna ytor, olika fokalplan (dvs olika positioner i z-riktning) kan specificeras för varje OCT Scan.
En uppsättning mjukvarupaket utvecklades för att bearbeta RAW OCT-skanningar (tabell 1). Navigering på positionerings enheten, OCT Scan förvärv och databearbetning utförs med python-kodade Jupyter notebooks, som möjliggör anmärkningsvärd flexibilitet i utvecklingen och optimering av programvaran. Två arbetade och kommenterade exempel på sådana anteckningsböcker (för bild förvärv och bearbetning, respektive) är tillgängliga från https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git de är avsedda som utgångspunkt för anpassning av metoden. En Jupyter Notebook är en webbläsare baserat program som innehåller celler med kommenterade python-kod. Varje steg ingår i en cell i anteckningsboken, som kan köras separat. På grund av den olika längden av ljusbanan genom Scan Lens (sfärisk aberration)15, den råa Oct skannar verkar förvrängd (figur 2A). Vi utvecklade en algoritm för att automatiskt korrigera för denna förvrängning i förvärvade OCT-skanningar (som finns i ImageProcessing. ipynb, kompletterande fil 1). Dessutom kan biofilmmorfologi visualiseras som en 2D höjd karta, som tidigare användes i membransystem16, och vi illustrerar hur höjd kartor som erhållits från skanningar tagna i en plattsättning array kan sys.
Slutligen illustreras funktionaliteten hos den beskrivna laboratorie installationen med hjälp av ett FLUME-experiment där phototrophic Stream biofilm utsätts för en gradient av flödeshastigheten.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT Imaging lämpar sig väl för att lösa strukturer i mikrometerområdet med en FOV av flera kvadratmillimeter. Det är alltså ett kraftfullt verktyg för biofilmforskning10,18. Men, OCT är för närvarande begränsad till en maximal skanningsyta på 100-256 mm2, medan biofilm strukturella mönster ofta överstiger denna rumsliga skalan19, särskilt när morfologisk differentiering drivs av storskaliga miljö gradienter <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Mauricio Aguirre Morales för hans bidrag till utvecklingen av detta system. Finansiellt stöd kom från Swiss National Science Foundation till T.J.B.
Materials
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
References
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).
- Flemming, H. -. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature reviews. Microbiology. 14, 563 (2016).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop. Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).
- Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Microbiology. 14, 251-263 (2016).
- Battin, T. J., et al. Microbial landscapes: new paths to biofilm research. Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).
- Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm. J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002 (2016).
- Wagner, M., Horn, H. Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review. Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
- Haisch, C., Niessner, R. Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography. Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. . Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , (2008).
- Fercher, A. F. Optical coherence tomography – development, principles, applications. Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).
- Lee, H. -. C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy. Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).
- Fortunato, L., Leiknes, T. In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping. Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).
- Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).
- Roche, K. R., et al. Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams. Water Resources. 53, 222-236 (2016).
- Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor. Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).
