हम यहां प्रत्येक कायखंड व्युत्पंन में मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल के भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद (myotome, श्वेतकोष्ठिका, dermatome, और syndetome) में रासायनिक परिभाषित शर्तों, जो भविष्य रोग मॉडलिंग में आवेदन किया है और आर्थोपेडिक सर्जरी में कोशिका आधारित चिकित्सा ।
इस तरह के संकेतों के जवाब में WNTs के रूप में, अस्थि मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन (BMPs), और ध्वनि हाथी (SHH) आसपास के ऊतकों से स्रावित, somites (एसएमएस) एक से अधिक सेल प्रकार के लिए वृद्धि दे, myotome (MYO), स्कलेकोटोम (SCL), त्वचीय , जो बदले में कंकाल की मांसपेशी, अक्षीय कंकाल, पृष्ठीय डर्मिस, और अक्षीय कंडरा/स्नायु में क्रमशः विकसित होता है । इसलिए, मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) से एसएमएस और उनके डेरिवेटिव के उत्पादन पुनर्योजी चिकित्सा में आवेदन के लिए pluripotent स्टेम सेल (पीएससीएस) प्राप्त करने के लिए और आर्थोपेडिक सर्जरी के क्षेत्र में रोग अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण है । यद्यपि पीपीएससी से MYO और SCL के लिए प्रेरण प्रोटोकॉल पहले कई शोधकर्ताओं द्वारा सूचित किया गया है, कोई अध्ययन अभी तक iPSCs से SYN और डी की प्रेरण का प्रदर्शन किया है । इसलिए, पूर्णत सक्षम एसएमएस को प्रभावी रूप से शामिल करना एक बड़ी चुनौती बनी हुई है । यहां, हम मानव एस के साथ patterning पर कब्जा कर लेना विट्रो में चिकी के दौरान संकेतन वातावरण नकल द्वारा (), और एसएम डेरिवेटिव के व्यवस्थित प्रेरण के तरीकों पर रिपोर्ट (MYO, SCL, डी, और SYN) मानव iPSCs से रासायनिक के तहत presomitic मध्यजनस्तर (पीएसएम) और एसएम राज्यों के माध्यम से परिभाषित शर्तों । मानव आईपीएससी के साथ एसएमएस को शामिल करने के लिए चिक/माउस के संबंध में ज्ञान का सफलतापूर्वक प्रयोग किया गया । इस विधि भ्रूण के उपयोग के बिना और कोशिका आधारित चिकित्सा और रोग मॉडलिंग के लिए मानव somitogenesis और patterning के अध्ययन के लिए एक उपंयास उपकरण हो सकता है ।
पीएससी से वांछित कोशिका प्रकार के लिए एक निर्देशित विभेदन विधि का विकास करना एक आवश्यक कदम है, जो पी एस सी-व्युत्पन्न कोशिकाओं के अध्ययन को नैदानिक अनुप्रयोगों में अनुवाद करने के लिए है । मुख्य जीनों की जबरिया अभिव्यक्ति के लिए एक आशाजनक रणनीति अंग-कोशिका विभेदन पीएससीज से और कोशिका भाग्य निर्धारण के आनुवंशिक विनियमन के बारे में हमारी समझ में सुधार हुआ है, अंग की उत्पत्ति, और भ्रूणोद्भव के दौरान संगठन1. इसके अतिरिक्त, अंतर्जात संकेतन वातावरणों को पुनर्पूंजीकरण, एक रोडमैप के रूप में माउस और चिक भ्रूणों के विकास का उपयोग करते हुए, पीएससीज के निर्देशित विभेदन के लिए आवश्यक माना जाता है । तथापि, नैदानिक अध्ययनों में पीएससी द्वारा व्युत्पन्न प्रकोष्ठों जैसे कि कोशिका आधारित चिकित्सा के अनुप्रयोग को देखते हुए बाद की कार्यनीति अधिक उपयुक्त है क्योंकि इसमें जीन हेरफेर की आवश्यकता नहीं है ।
अनेक अध्ययनों में रासायनिक रूप से परिभाषित दशाओं में मानव और मूषक पीएससीज से मध्यजनस्तर की प्रेरण की सूचना दी गई है । आम तौर पर, इन तरीकों activin पर भरोसा किया है/नोडल/बदलने विकास कारक β (tgfβ) सिग्नलिंग और अस्थि संरचनाआनुवंशिक प्रोटीन (BMP) संकेतन, meso-endoderm और मध्यजनस्तर भेदभाव करने के लिए माना जाता है, एक कम प्रेरण दक्षता में जिसके परिणामस्वरूप पैराअक्षीय मध्यजनस्तर (लगभग 20%)2 दूसरे शब्दों में, इन सिग्नलिंग पथों से उत्पन्न पीएससी-व्युत्पन्न मध्यजनस्तर मुख्य रूप से पार्श्व प्लेट मध्यजनस्तर था, न कि पैराअक्षीय मध्यजनस्तर । हाल ही में, कुछ अध्ययनों ने विभिन्न रणनीतियों के आधार पर पीएससी के कुशल उत्पादन-पार्क्षीय मध्यजनस्तर का प्रदर्शन किया है3,4,5,6,7,8 . इन अध्ययनों में, पीएससी को ग्लाइकोजन सिंथेज़ काइनेज 3 (GSK3) अवरोधकों (wnt सिग्नलिंग एक्टिवेटर्स) की अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता के साथ सुसंस्कृत किया गया था, फलस्वरूप परअक्षीय मध्यस्तर की प्रेरण दक्षता 70% – 95%6,7 तक पहुंच गई । .
सोमैटोजेनेसिस में पैराअक्षीय मध्यजनस्तर पहले से ही अग्रवर्ती मध्यजनस्तर (पीएसएम) का रूप दिया जाता है और उसके बाद मध्यभाग में मेजेन्काइम-से-उपकला संक्रमण9,10के माध्यम से सोमिटीज (एसएमएस) बनाता है । पायदान लिगामेंट डेल्टा-1 की तरह (DLL1) somitogenesis के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका के लिए जाना जाता है, के रूप में DLL1 अभिव्यक्ति के दोलनी नियंत्रण, दोनों mrna और प्रोटीन स्तर में, SM segmentation को नियंत्रित करता है. एसएमएस अंततः दो भागों में विभाजित, dermomyotome (डीएम) डोरसैली और स्कलेरटोम (एससीएल) ventrally11को जंम दे रही है । बाद में, डीएम डर्मिस (डी), dermis के एक अग्रदूत, और myotome (MYO), कंकाल की मांसपेशी का एक अग्रदूत के रूप में अंतर करता है; इसके अतिरिक्त, SCL का एक अधर भाग syndetome (SYN), tendons और स्नायुबंधन के अग्रदूत (1 चित्रा) रूपों । कुछ शोधकर्ताओं ने इस तरह के myo4,13 और एससीएल14के रूप में पीएससी व्युत्पंन SM डेरिवेटिव के प्रेरण की सूचना दी है; हालांकि, इन अध्ययनों में कई सीमाएं हैं । विशेष रूप से, डी और SYN के संकेतन वातावरण के बारे में हमारी जानकारी खंडित है, डी और SYN के लिए प्रेरण प्रोटोकॉल अभी तक व्यवस्थित रूप से स्थापित नहीं किया गया है । पीएससीज से पे्ररित एसएमएस की पूर्ण क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए सभी चार व्युत्पन्नों (डी, माइयो, एससीएल और सिन) में प्रेरित एसएमएस की बहु-विभेदन क्षमता को दर्शाना आवश्यक है, जबकि पिछले अध्ययनों में केवल विशिष्ट एसएम व्युत्पन्नों पर ही ध्यान केन्द्रित किया गया है । यहां, हम कैसे डी और SYN सहित सभी चार sm डेरिवेटिव, उत्पंन करने पर रिपोर्ट psm और sm फैट्स के माध्यम से मानव ipscs15। हमारा मानना है कि एक इन विट्रो पदश: विधि की स्थापना है कि मॉडल sm विकास प्रक्रिया कैसे मानव SM embryogenesis के दौरान विकसित का अध्ययन करने के लिए योगदान सकता है, भ्रूण का उपयोग कर के बिना ।
पीएसएम के माध्यम से पीएससी-व्युत्पन्न एसएम को शामिल करने की एक सुविदित विधि पीएससी से पीएसएम प्रेरण के दौरान CHIR99021 + A83-01 (TGFβ inhibitor) का संयोजन है, लेकिन पीएसएम परिपक्वता प्रक्रिया के दौरान नहीं। वर्तमान अध्ययन में, WNT/बीटा-catenin संकेतन को C59 का उपयोग करके PSM से SM को प्रेरित करने में हिचकते थे । हालांकि, हम CHIR99021 का उपयोग शुरू करने के लिए SM भिंनता के दौरान WNT मार्ग को सक्रिय करें । यह निर्णय इस निष्कर्ष पर आधारित था कि कई WNTs एसएम के आसपास के ऊतकों में व्यक्त कर रहे हैं और इस तथ्य को देखते हुए कि डब्ल्यूएनटी रिपोर्टर्स एसएम20में सक्रिय हैं । एक परिणाम के रूप में, हम CHIR99021 के साथ शर्त के तहत, केवल सेल-सेल जंक्शनों में CDH11 के संचय पर आधारित, vivo में SM की एक विशेषता उपकला, मनाया (चित्रा 2E) । यह प्रेक्षण पीएसएम विभेदन और एसएम उपकला के दौरान डब्ल्यूएनटी संकेतन की महत्वपूर्ण भागीदारी को इंगित करता है, इसलिए हमारा प्रोटोकॉल अंतर्जात संकेतन वातावरण को बेहतर रूप से पुनर्ग्रहण कर सकता है । हालांकि, यह भी भेदभाव के दौरान WNT/बीटा-catenin संकेतन मार्ग ट्यूनिंग ठीक की एक और संभावना का तात्पर्य है, क्योंकि मजबूती और भेदभाव की क्षमता काफी सेल प्रकार, सेल लाइनों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, और विभिन्न प्रत्येक शोधकर्ता द्वारा इस्तेमाल किए जाने वाले WNT-inducers के रासायनिक यौगिकों ।
इस विधि भी हम सभी चार SM डेरिवेटिव, MYO, डी, SCL, और SYN, मानव iPSCs से उत्पंन करने के लिए अनुमति देता है । हमारे पदश: प्रोटोकॉल cdm का उपयोग कर मानव somitogenesis के दौरान संकेतन आवश्यकताओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता/ उदाहरण के लिए, हमारे तरीकों विभाजन घड़ी तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता है, एक आणविक दोलन प्रणाली है कि एसएम के गठन को नियंत्रित करता है । यह अच्छी तरह से चूहों, लड़कियों, और zebrafish में जांच की गई है, लेकिन उचित प्रयोगात्मक उपकरणों की कमी के कारण मनुष्यों में नहीं ।
इसके अलावा, हमारी विधि भविष्य नैदानिक कोशिका आधारित चिकित्सा के लिए लागू किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, मानव iPSC-डी या SYN व्युत्पंन गंभीर रूप से घायल त्वचा या उत्थान और उपचार के लिए उठी tendons में प्रत्यारोपित किया जा सकता है । हालांकि, इस विधि व्यावहारिक रूप से लागू किया जा सकता से पहले कई सीमाएं हल करने की आवश्यकता है । हालांकि वर्तमान अध्ययन में, हम ipsc रखरखाव और ecm समाधान है, जो engelbreth से निकाला जाता है के लिए SNL फीडर कोशिकाओं का इस्तेमाल किया-holm-झुंड माउस सारकोमा, प्रेरण के दौरान पकवान पर एक सतह कोट के रूप में, इन गैर मानव पशु व्युत्पंन अभिकर्मकों होना चाहिए नैदानिक गुणवत्ता में सुधार करने के लिए हटा दिया । इसके अलावा, सेल मात्रा और गुणवत्ता, जो शुद्धता और वांछित कोशिकाओं की परिपक्वता शामिल है, भी सुधार किया जाना चाहिए । इसके अलावा, न केवल सेल संख्या लेकिन यह भी कोशिका शक्ति कण्डरा के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषता है/ इसके अतिरिक्त, शुद्धि के लिए सतह मार्कर और 3 डी पुनर्गठन के लिए एक उपंयास विधि के विकास के लिए नैदानिक सेल आधारित चिकित्सा के लिए हमारे प्रोटोकॉल अग्रिम करने के लिए अपरिहार्य हैं ।
The authors have nothing to disclose.
हम डॉ का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । परियोजना प्रशासन और धन अधिग्रहण के साथ उनकी मदद के लिए, श्री मित्सुकी Shibata (cira) और सुश्री मेई Terashima (सीआईआरए) उनकी तकनीकी सहायता के लिए, डॉ Yayoi Toguchida (सीआईआरए) और डॉ दैसूक कामिया (cira) के लिए जून्या Toguchida पांडुलिपि के अपने प्रूफरीडिंग, और श्री मकाया Todani (CiRA) एक उदाहरण प्रदान करने के लिए (चित्रा 1) । हम भी इस अध्ययन के दौरान उनके समर्थन के लिए Ikeya और Toguchida प्रयोगशालाओं (CiRA) के सभी सदस्यों को धन्यवाद. यह काम जापान सोसायटी (JSPS) (२६६७०६६१), असभ्य रोगों अनुसंधान के लिए कार्यक्रम जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी से रोग विशिष्ट आईपीएस कोशिकाओं का उपयोग करने से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान सहायता द्वारा समर्थित किया गया था एजेंसी (JST) और चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए जापान एजेंसी (AMED), प्रमुख पुनर्योजी चिकित्सा की प्राप्ति के लिए अनुसंधान केंद्र नेटवर्क के आईपीएस सेल अनुसंधान के लिए केंद्र (JST/ जुन्या तोगुचिडा) । Makoto Ikeya भी सहायता अनुदान द्वारा वैज्ञानिक अनुसंधान (JSPS) (16H05447) और असभ्य रोगों अनुसंधान के लिए रोग विशिष्ट आईपी कोशिकाओं (AMED) का उपयोग करने के लिए त्वरण कार्यक्रम के लिए समर्थन किया गया था ।
ALX4_Goat antibody | Santacruz | sc-22066 | |
Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
BMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
BMP7 | R&D | 354-BP-010 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A8806 | |
Calcium chloride | Nacalai tesque | 067730-15 | |
CDH11_Mouse antibody | Cell signaling | 13577 | |
Cell streching device | Strex | STB-140 | |
Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905-031 | |
CHIR99021 | Axon | 1386 | |
COL1A1_Rabbit antibody | Abcam | ab34710 | |
COL2A1_Mouse antibody | Thermo scientific | MS-235 | |
Collagenase IV | Thermofisher | 17104019 | |
DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody | R&D | FAB1818A | For FACS |
DMEM | Sigma | D6046 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-082 | |
DMH1 | Tocris | 4126 | |
EN1_Rabbit antibody | Abcam | ab70993 | |
Fetal bovine serum | Nichirei | 171012 | |
FGF2 | Wako | 060-04543 | |
FGF8 | Peprotech | 100-25 | |
Human dermal fibroblast | Cell applications | 160-05a | |
Human tenocyte | Angio proteomie | cAP-0041 | |
Insulin | Wako | 090-06474 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12 | Gibco | 21056023 | |
Knockout SR | Gibco | 10828028 | |
LDN193189 | Axon | 1509 | |
Matrigel | BD bioscience | 354230 | Artificial extracellular matrix |
MEOX1_Rabbit antibody | Abcam | ab75895 | |
MHC_Rabbit antibody | Santacruz | sc-20641 | |
MKX_Rabbit antibody | Atlas antibodies | A83377 | |
Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
mTeSR1 | Stemcell tech | 85850 | |
Multi well-type silicon rubber chamber | Strex | STB-CH-4W | |
MYOD_Rabbit antibody | Abcam | ab133627 | |
MYOG_Mouse antibody | Santacruz | sc-12732 | |
NKX3.2_Rabbit antibody | Sigma | HPA027564 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21432 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21447 | |
Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21422 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21428 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21245 | |
PARAXIS_Rabbit antibody | Santacruz | sc-98796 | |
PAX1_Rabbit antibody | Abcam | ab95227 | |
PAX9_Rabbit antibody | Gene tex | GTX104454 | |
PBS | – | – | |
PDGFRa_Goat | R&D | AF307 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Primate ES cell medium | Reprocell | RCHEMD001 | |
SAG | Calbiochem | 566661 | |
SB431542 | Selleckchem | SEL-S1067-10 | |
SCX_Rabbit antibody | Abcam | ab58655 | |
TBX6_Goat antibody | R&D | AF4744 | |
Tendon cell growth medium | Angio-proteomie | cAP-40 | Tenocytes growth medium |
TGFβ3 | R&D | 243-B3-200 | |
Trypsin | Gibco | 15090046 |