Høj kapacitet trækkraft mikroskopi ved hjælp af PDMS afslører dosis-afhængige effekter af omdanne vækstfaktor-β på epitelial-til-Mesenchymal overgang
Summary
Vi præsenterer en høj gennemløb Traction Force assay fremstillet med silikone gummi (PDMS). Denne nye analyse er egnet til at studere fysiske ændringer i cellernes kontraktilitet under forskellige biologiske og biomedicinske processer og sygdomme. Vi demonstrerer denne metodes anvendelighed ved at måle en TGF-β afhængig stigning i kontraktilitet under epithelial-til-mesenchymal overgangen.
Abstract
Cellulære kontraktilitet er afgørende i forskellige aspekter af biologi, kørsel processer, der spænder fra motilitet og division, til væv sammentrækning og mekanisk stabilitet, og repræsenterer et centralt element i multi-cellulære dyrs liv. I vedklædige celler ses acto-myosin-sammentrækning i trækkraft, som cellerne udøver på deres substrat. Dysregulering af cellulære kontraktilitet vises i et utal af patologier, hvilket gør kontraktilitet et lovende mål i forskellige diagnostiske tilgange ved hjælp af Biofysik som en metrisk. Desuden kan nye terapeutiske strategier være baseret på at korrigere den tilsyneladende fejl i celle kontraktilitet. Disse anvendelser kræver imidlertid en direkte kvantificering af disse kræfter.
Vi har udviklet silikoneelastomer-baseret Traction Force mikroskopi (TFM) i et paralleliseret multi-Well-format. Vores brug af en silikone gummi, specifikt Polydimethylsiloxan (PDMS), snarere end den almindeligt anvendte hydrogel polyacrylamid (PAA) gør os i stand til at gøre robuste og inaktive substrater med ubestemt hylde-liv kræver ingen særlige opbevaringsforhold. I modsætning til søjle-PDMS-baserede tilgange, der har en modulus i GPa-området, er de PDMS, der anvendes her, meget overensstemmende, lige fra ca. 0,4 kPa til 100 kPa. Vi skaber en platform til højt gennemløb for TFM ved at opdele disse store monolitiske substrater rumligt i biokemisk uafhængige brønde, hvilket skaber en multi-Well platform for Traction Force screening, der er kompatibel med eksisterende multi-Well-systemer.
I dette manuskript bruger vi dette multi-Well Traction Force system til at undersøge epitelial til Mesenchymal Transition (EMT); Vi inducerer EMT i NMuMG celler ved at udsætte dem for TGF-β, og at kvantificere de biofysiske ændringer under EMT. Vi måler kontraktilitet som en funktion af koncentrationen og varigheden af TGF-β eksponering. Vores resultater her demonstrere nytten af angreb TFM i forbindelse med sygdom biophysics.
Introduction
Acto-myosin kontraktilitet er et væsentligt element i aktiv celle mekanik, påvirker celle adfærd fra motilitet og spredning til stamcelle differentiering. I væv, kontraktilitet drevaktivitet fra Polar adskillelse i embryo Genesis, til luftvejs indsnævring og hjerteaktivitet. Kritisk, at generere spændinger, celler skal først overholde deres ekstracellulære miljø. Derved genererer denne kontraktilitet trækkraft kræfter på deres omgivelser. Trækkraft mikroskopi (TFM) er dukket op i en lang række former som en måde at kvantificere disse kræfter fra forskellige celler under forskellige forhold.
TFM-området har oplevet en exceptionel bredde af innovation og anvendelse, og resultaterne har banet vejen for nye perspektiver inden for biologi, som inkorporerer mekanik og fysiske kræfter. Begyndende med rynkning silikone substrater1, forskere har anvendt forskellige teknikker til at målecelle trækkraft kræfter. Disse tilgange er blevet løbende forbedret og har nu nået et niveau af beslutning om rækkefølgen af flere mikron2. Der er imidlertid opstået et hovedproblem, som er vanskeligheden ved at skabe substrater af passende lav moduli ved hjælp af de tilgængelige silikegler. For at omgå dette problem, blev polyacrylamid vedtaget som en erstatning på grund af den lethed at skabe substrater på rækkefølgen af 1-20 kPa3. Vi har for nylig implementeret meget kompatible silikegler i TFM4, hvilket giver os mulighed for at fabrikere det samme sortiment af moduli som polyacrylamid, men med fordelene ved inert og robust silikone.
TFM tilgange har gjort det muligt værdifulde mechano-biologiske opdagelser, men, en vedvarende mangel er deres kompleksitet, ofte begrænser deres anvendelse til forskere i ingeniørvidenskab eller fysiske videnskaber discipliner. Dette skyldes for en stor del de detaljerede kalibreringer og udfordrende beregninger, der er nødvendige for at kvantificere kontraktilitet. En anden væsentlig udfordring er, at TFM metoder er stort set lav-gennemløb og derfor dårligt egnet til at studere mange forskellige betingelser eller populationer samtidigt5. Dette har vist en flaskehals, som har hæmmet overdragelsen af TFM fra en specialist Biofysik til bredere biologiske og farmakologiske anvendelser.
Vi har for nylig udviklet en multi-Well format TFM plade, som giver forskerne mulighed for at parallelér deres TFM målinger for hurtigere kvantificering af kontraktilitet Metrics, mens udforske virkningen af forskellige forbindelser og også ved hjælp af mindre reagenser4 . Denne metode har bred nytte i forskellige mechanobiologi undersøgelser, fra at evaluere virkningerne af forbindelser på cellulære aktivitet, at kvantificere de kontraktile ændringer i differentiering eller sygdom.
Et område af biomedicinsk forskning, der vil drage stor fordel af TFM er studiet af, hvordan fysiske stikord påvirker de maligne fænotyper af kræftceller. Metastase, ansvarlig for 90% af Cancer-relaterede dødsfald, er karakteriseret ved kræftceller forlader deres oprindelige tumor site og koloniserer et sekundært sted. For celler til at migrere gennem vævet og passere ind og ud af det vaskulære system, skal de radikalt ændre deres former til at klemme gennem disse fysiske barrierer, samtidig med at generere betydelige kræfter til at trække sig vej langs ekstracellulære matrix eller flytte mellem andre Celler. Disse kræfter overføres til substratet gennem fokale vedhæftnings interaktioner2,3og kan kvantificeres ved hjælp af TFM. Mens kræft er biologisk kemisk usædvanligt forskelligartet, med en ekspanderende repertoire af kendte mutationer og protein ændringer, nogle almindelige fysiske ændringer er blevet observeret; i en række forskellige kræftformer, herunder bryst-, prostata-og lungekræft, har metastatiske celler vist sig at udøve 2-3 gange Trækkraft kræfterne i ikke-metastatiske celler6,7,8. Disse resultater tyder på, at der kan være en stærk sammenhæng mellem metastatisk progression og trækkraft kræfterne udøvet af celler; Det er imidlertid vanskeligt at undersøge de detaljerede tidsafhængige ændringer i kontraktilitet.
Epitel-til-mesenchymal Transition (EMT) er en proces, hvorved cellerne reducerer vedhæftnings-og tight-Junction medieret celle-celle adhæsion, bliver mere vandrende og invasiv. Ud over fysiologiske funktioner, der omfatter sårheling og udviklingsmæssige processer, EMT er også en proces udnyttes under metastase, hvilket gør det til et nyttigt model system til at studere denne proces. Ved hjælp af TGF-β, vi kan fremkalde EMT i murine bryst epitelceller (nmumg)9 at direkte kvantificere de fysiske ændringer under denne transformation, og karakteriserer den tid og dosis-afhængige effekter af TGF-β på EMT og celle kontraktilitet. I denne artikel viser vi nytten af denne tilgang ved at måle ændringerne i kontraktilitet under en induceret EMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at denne metode skal lykkes, er det afgørende at have en ensartet belagt prøve med en konstant tykkelse på ca. 100 μm. Modulus bør nøje vælges for at undersøge den fysiske betydning af det biologiske system af interesse. Ved fremstilling af et toplag, bør koncentrationen af de fiducial fluorescerende partikler optimeres for nøjagtig analyse af forskydning og trækkraft stress. Analyse af isolerede enkeltceller kræver et tættere fiduciært lag end måling af konfluent-monolayers. Derudover skal overfladen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Tom Kodger, Michael Landry og Christopher J. Barrett for hjælp med perle syntese. A.J.E. anerkender naturvidenskab og ingeniør forskning Rådet tilskud RGPIN/05843-2014 og EQPEQ/472339-2015, canadiske institutter for sundhed forskning Grant No. 143327, canadiske Cancer Society Grant No. 703930, og Canadian Foundation for innovation Projekt #32749. R. Krishnan anerkender nationale institutter for sundhedstilskud nr. R21HL123522 og R01HL136209. H.Y. blev støttet af fonds de Recherche santé Québec og fonds de Recherche Nature et Technologies Québec. Forfatterne takker Johanan Idicula for at hjælpe med video og manuskript og Zixin he for at hjælpe med at forberede videoen.
Materials
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP | |
References
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. Traction forces in locomoting cells. Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells. Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).
- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
