Hoge doorvoer Tractiekracht microscopie met behulp van PDM'S onthult dosisafhankelijke effecten van het transformeren van groei factor-β op de epitheliale-naar-mesenchymale overgang
Summary
We presenteren een hoge doorvoer tractiekracht assay gefabriceerd met silicone rubber (PDMS). Deze nieuwe assay is geschikt voor het bestuderen van fysieke veranderingen in cel contractiliteit tijdens verschillende biologische en biomedische processen en ziekten. We demonstreren het nut van deze methode door het meten van een TGF-β afhankelijke toename van de contractiliteit tijdens de epitheel-naar-mesenchymale overgang.
Abstract
Cellulaire contractiliteit is essentieel in diverse aspecten van de biologie, rijprocessen die variëren van beweeglijkheid en verdeling tot weefsel contractie en mechanische stabiliteit, en vertegenwoordigt een kernelement van multi-cellulaire dier leven. In aanhandige cellen wordt acto-myosine contractie gezien in tractie krachten die cellen op hun substraat uitoefenen. Disregulatie van cellulaire contractiliteit verschijnt in een groot aantal pathologieën, het maken van contractiliteit een veelbelovend doelwit in diverse diagnostische benaderingen met behulp van biofysica als een metriek. Bovendien kunnen nieuwe therapeutische strategieën worden gebaseerd op het corrigeren van de schijnbare storing van de celcontractiliteit. Deze toepassingen vereisen echter een directe kwantificering van deze krachten.
We hebben op siliconen elastomeer gebaseerde tractiekracht microscopie (TFM) ontwikkeld in een geparallelliseerd multi-well formaat. Ons gebruik van een Silicone rubber, specifiek Polydimethylsiloxaan (PDM’S), in plaats van de vaak gebruikte hydrogel Polyacrylamide (PAA) stelt ons in staat om robuuste en inerte ondergronden te maken met een onbepaalde houdbaarheid-levens waarvoor geen gespecialiseerde bewaarcondities nodig zijn. In tegenstelling tot pijler-PDMS gebaseerde benaderingen die een modulus in het GPa-bereik hebben, zijn de PDM’S die hier worden gebruikt zeer compliant, variërend van ongeveer 0,4 kPa tot 100 kPa. We creëren een platform voor hoge doorvoer voor TFM door deze grote monolithische substraten ruimtelijk te partitioneren in biochemisch onafhankelijke putten, waardoor een multi-well platform ontstaat voor het screenen van tractiekracht dat compatibel is met bestaande multi-well systemen.
In dit manuscript gebruiken we dit multi-well Traction Force-systeem om de epitheel naar mesenchymale transitie (EMT) te onderzoeken; we induceren EMT in NMuMG cellen door ze bloot te stellen aan TGF-β, en om de biofysische veranderingen te kwantificeren tijdens EMT. We meten de contractiliteit als een functie van concentratie en duur van TGF-β-blootstelling. Onze bevindingen hier tonen het nut van geparallelliseerde TFM in de context van ziekte Biophysics.
Introduction
Acto-myosin contractiliteit is een essentieel element van actieve celmechanica, invloed op het gedrag van de cellen van beweeglijkheid en proliferatie tot stamcel differentiatie. In weefsels drijft contractiliteit activiteit van polaire scheiding in embryogenese, tot vernauwing van de luchtwegen en cardiale activiteit. Kritisch, om spanning te genereren, cellen moeten eerst zich houden aan hun extracellulaire omgeving. Daarbij genereert deze contractiliteit tractie krachten op hun omgeving. Traction Force microscopie (TFM) is ontstaan in een veelheid van vormen als een manier om deze krachten te kwantificeren uit verschillende cellen onder verschillende omstandigheden.
Het veld van TFM heeft een uitzonderlijke breedte van innovatie en toepassing gezien en de resultaten hebben de weg vrijgemaakt voor nieuwe perspectieven in de biologie, die mechanica en fysieke krachten omvatten. Beginnend met rimpel siliconen substraten1, onderzoekers hebben verschillende technieken toegepast om de tractie krachten van cellen te meten. Deze benaderingen zijn voortdurend verbeterd en hebben nu een niveau van resolutie bereikt over de volgorde van verschillende micron2. Er is echter één hoofdprobleem ontstaan, namelijk de moeilijkheid om substraten met voldoende lage moduli te maken met behulp van de beschikbare siliconen. Om dit probleem te omzeilen, werd Polyacrylamide als vervanging gekozen door het gemak van het maken van substraten op de orde van 1-20 kPa3. We hebben onlangs zeer conforme siliconen in TFM4geïmplementeerd, waardoor we hetzelfde bereik van moduli kunnen fabriceren als Polyacrylamide, maar met de voordelen van inerte en robuuste siliconen.
TFM-benaderingen hebben waardevolle mechano-biologische ontdekkingen mogelijk gemaakt, maar een hardnekkige tekortkoming is hun complexiteit, waardoor ze vaak hun gebruik beperken tot onderzoekers in de engineering-of fysische wetenschappen disciplines. Dit is grotendeels te wijten aan de gedetailleerde kalibraties en uitdagende berekeningen die nodig zijn om de contractiliteit te kwantificeren. Een andere belangrijke uitdaging is dat TFM-methoden grotendeels lage doorvoer zijn en daarom niet geschikt zijn om veel verschillende omstandigheden of populaties tegelijkertijd te bestuderen5. Dit heeft een knelpunt gepresenteerd, dat de overdracht van TFM van een gespecialiseerde biofysica-instelling in bredere biologische en farmacologische toepassingen heeft belemmerd.
We hebben onlangs ontwikkeld een multi-well formaat tfm plaat, waarmee onderzoekers parallel hun tfm metingen voor het sneller kwantificeren van contractiliteit metrische gegevens, terwijl het verkennen van de impact van verschillende verbindingen en ook met behulp van minder reagentia4 . Deze methodologie heeft een breed nut in diverse mechanobiologie studies, van het evalueren van de effecten van verbindingen op cellulaire activiteit, voor het kwantificeren van de contractiele veranderingen in differentiatie of ziekte.
Een gebied van biomedisch onderzoek dat sterk zal profiteren van TFM is de studie van de invloed van fysieke signalen op de kwaadaardige fenotypes van kankercellen. Metastase, verantwoordelijk voor 90% van de kanker-gerelateerde sterfgevallen, wordt gekenmerkt door tumorcellen verlaten hun oorspronkelijke tumor site en koloniseren van een secundaire site. Voor cellen om te migreren via weefsel en doorgeven in en uit het vasculaire systeem, ze moeten radicaal veranderen hun vormen te persen door deze fysieke barrières terwijl het genereren van aanzienlijke krachten om te trekken hun weg langs extracellulaire matrix of verplaatsen tussen andere Cellen. Deze krachten worden overgebracht naar het substraat door middel van focale adhesie interacties2,3, en kunnen worden gekwantificeerd met behulp van tfm. Hoewel kankers biologisch chemisch uitzonderlijk divers zijn, met een groeiend repertoire van bekende mutaties en eiwit veranderingen, zijn enkele veelvoorkomende fysieke veranderingen waargenomen; in verschillende vormen van kanker, waaronder borst-, prostaat-en longkanker, is gebleken dat gemetastaseerde cellen 2-3 keer de tractie krachten van niet-metastatische cellen6,7,8moeten uitoefenen. Deze resultaten suggereren dat er een sterke correlatie kan zijn tussen metastatische progressie en de tractie krachten die door cellen worden uitgeoefend; de gedetailleerde tijdsafhankelijke veranderingen in contractiliteit zijn echter moeilijk te onderzoeken.
De epitheel-to-mesenchymale transitie (EMT) is een proces waarbij cellen de hechting van de cel en de nauw verbonden celceladhesie verminderen, en steeds meer migratie en invasief worden. Naast fysiologische functies die wondgenezing en ontwikkelingsprocessen omvatten, EMT is ook een proces dat wordt uitgebuit tijdens metastasen, waardoor het een nuttig modelsysteem om dit proces te bestuderen. Met behulp van TGF-β, we kunnen induceren de EMT in Murine borstklier epitheelcellen (NMuMG)9 direct kwantificeren van de fysieke veranderingen tijdens deze transformatie, en karakteriseren de tijd en de dosis-afhankelijke effecten van TGF-β op EMT en cel contractility. In dit artikel, we demonstreren het nut van deze aanpak door het meten van de veranderingen in contractiliteit tijdens een geïnduceerde EMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor het succes van deze methode is het van cruciaal belang om een gelijkmatig gecoat monster met een constante dikte van ongeveer 100 μm te hebben. De modulus moet zorgvuldig worden gekozen om de fysieke betekenis van het biologisch systeem van belang te onderzoeken. Bij het vervaardigen van een toplaag, moet de concentratie van de fiducial fluorescerende deeltjes worden geoptimaliseerd voor een nauwkeurige analyse van verplaatsing en tractie stress. Het analyseren van geïsoleerde enkelvoudige cellen vereist een dicht…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Tom Kodger, Michael Landry, en Christopher J. Barrett voor hulp bij de kraal synthese. A.J.E. erkent de Raad natuurwetenschappen en ingenieurs onderzoek, verleent RGPIN/05843-2014 en EQPEQ/472339-2015, Canadian Institutes of Health Research Grant No. 143327, Canadian kanker Society Grant No. 703930 en Canadian Foundation for Innovation Project #32749. R. Krishnan erkent nationale instituten voor gezondheidszorg Grant No. R21HL123522 en R01HL136209. H.Y. werd gesteund door Fonds de Recherche Santé Québec en Fonds de Recherche Nature et Technologies Québec. De auteurs bedanken Johanan Idicula voor hulp bij de video en manuscript en Zixin he voor hulp bij het voorbereiden van de video.
Materials
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP | |
References
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. Traction forces in locomoting cells. Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells. Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).
- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
