Высокой пропускной силы тяги Микроскопия использованием PDMS показывает доз-зависимые эффекты преобразования фактор роста-я на Эпителиальный-к-мезенхимальный переход
Summary
Мы представляем высокую пропускную силу силы ассеис изготовлены с силиконовой резины (PDMS). Этот новый ассси подходит для изучения физических изменений в сотрудничности клеток во время различных биологических и биомедицинских процессов и заболеваний. Мы демонстрируем полезность этого метода, измеряя tGF-я зависимое увеличение контрактности во время эпителиального перехода к мезенхимальному.
Abstract
Сотовая контрактность имеет важное значение в различных аспектах биологии, движущих процессов, которые варьируются от подвижности и деления, для сокращения тканей и механической стабильности, и представляет собой основной элемент многоклеточной жизни животных. В клетках атто-миозина, акто-миосин сокращения наблюдается в тяговых сил, которые клетки оказывают на их субстрат. Дисрегуляция клеточной контрактильности появляется в множестве патологий, что делает контрактность перспективной мишенью в различных диагностических подходах с использованием биофизики в качестве метрики. Кроме того, новые терапевтические стратегии могут быть основаны на исправлении очевидной неисправности клеточной контрактности. Однако эти приложения требуют прямой количественной оценки этих сил.
Мы разработали силиконовую эластомерную масляную силовую микроскопию (TFM) в параллельном формате мультиколодца. Наше использование силиконовой резины, в частности полидиметилсилоксана (PDMS), а не широко используемых гидрогель полиакриламид (PAA) позволяет нам сделать надежные и инертные субстраты с неопределенным исполидных сроков хранения, не требующих специализированных условий хранения. В отличие от подходов на основе столба-PDMS, которые имеют модуль в диапазоне GPa, PDMS, используемый здесь, очень совместим, от примерно 0,4 кПа до 100 кПа. Мы создаем платформу высокой пропускной силы для TFM путем раздела этих больших монолитных субстратов, пространственно в биохимически независимых скважин, создавая многоскважинную платформу для скрининга силы тяги, совместимую с существующими многоскважинными системами.
В этой рукописи мы используем эту многостороннюю систему силы тяги для изучения Эпителия к мезенхимальному переходу (EMT); мы индуцируем EMT в клетках NMuMG путем подвергать их к TGF-я, и для того чтобы количественно биофизические изменения во время EMT. Мы измеряем сородичность как функцию концентрации и продолжительности воздействия TGF-я. Наши выводы здесь демонстрируют полезность параллелизированного TFM в контексте биофизики болезней.
Introduction
Контрактность акто-миозина является важным элементом активной клеточной механики, влияющим на поведение клеток от подвижности и пролиферации до дифференциации стволовых клеток. В тканях контрактность приводит к активности от полярного разделения при эмбриогенезе, к сужению дыхательных путей и сердечной деятельности. Критически, для того чтобы произвести напряжение, клетки должны сперва придерживаться к их внеклеточной окружающей среде. При этом эта договорность генерирует силы тяги на их окрестностях. Микроскопия силы тяги (TFM) вытекла в множество форм как путь к количественной оценке этих усилий от различных клеток на по-разному условиях.
Область TFM стала свидетелем исключительной широты инноваций и применения, и результаты проложили путь к новым перспективам в биологии, которые включают механику и физические силы. Начиная с морщинсиликоновых силиконовых субстратов1, исследователи применили различные методы для измерения сил тяги клеток. Эти подходы постоянно совершенствуются и в настоящее время достиглиуровня разрешения порядка нескольких микрон 2. Тем не менее, одна основная проблема возникла, которая является трудность в создании субстратов соответствующим низким модули с использованием имеющихся силиконов. Чтобы обойти эту проблему, полиакриламид был принят в качестве замены в связи с легкостью создания субстратов по заказу 1-20 кПа3. Недавно мы внедрили оченьсовместимые силиконы в TFM 4, что позволяет нам изготовить тот же диапазон модули, что и полиакриламид, но с преимуществами инертного и надежного силикона.
Подходы ТФМ позволили провести ценные механо-биологические открытия, однако постоянным недостатком является их сложность, часто ограничивающая их использование исследователями в инженерных или физических дисциплинах. Это в значительной степени объясняется подробными калибровками и сложными расчетами, которые необходимы для количественной оценки контрактности. Еще одной важной проблемой является то, что методы TFM в основном низкой пропускной способ и, следовательно, плохо подходит для изучения многих различных условий или популяций одновременно5. Это создало узкое место, которое препятствует переносу ТФМ из специализированной биофизики в более широкие биологические и фармакологические приложения.
Недавно мы разработали многоскважинную пластину TFM, которая позволяет исследователям параллелизировать свои измерения TFM для более быстрой количественной оценки показателей контрактности, исследуя влияние различных соединений, а также используя меньше реагентов4 . Эта методология имеет широкую полезность в различных исследованиях механобиологии, от оценки влияния соединений на клеточную активность до количественной оценки сократительных изменений в дифференциации или заболеваниях.
Одной из областей биомедицинских исследований, которые принесут большую пользу от TFM является изучение того, как физические сигналы воздействия злокачественных фенотипов раковых клеток. Метастаз, ответственный за 90% смертей, связанных с раком, характеризуется раковыми клетками, покидающих исходный участок опухоли и колонизирующих вторичном месте. Для клеток мигрировать через ткани и пройти в и из сосудистой системы, они должны радикально изменить свою форму, чтобы протиснуться через эти физические барьеры, генерируя значительные силы, чтобы тянуть свой путь вдоль внеклеточной матрицы или двигаться между другими Клетки. Эти силы передаются в субстрат через фокусные взаимодействия2,3и могут быть количественно с помощью TFM. В то время как раковые заболевания биохимически исключительно разнообразны, с расширяющимся репертуаром известных мутаций и белковых изменений, наблюдались некоторые общие физические изменения; в различных раковых заболеваний, в том числе молочной железы, простаты и рака легких, метастатические клетки были показаны оказывать 2-3 раза тяговые силы неметастатических клеток6,7,8. Эти результаты показывают, что может быть сильная корреляция между метастатическим прогрессированием и тяговые силы, оказываемые клетками; однако трудно изучить подробные временные изменения в контрактности.
Эпителиальный переход к мезенхимальному переходу (ЭМТ) представляет собой процесс, при котором клетки уменьшают адепты и плотное соединение опосредованное сливки клеток, становясь более мигрирующим и инвазивным. В дополнение к физиологическим функциям, которые включают заживление ран и процессы развития, EMT также процесс, используемый во время метастазирования, что делает его полезной модельной системой для изучения этого процесса. Используя TGF-я, мы можем побудить EMT в murine молочной эпителиальных клеток (NMuMG)9 непосредственно количественно физических изменений во время этой трансформации, и характеризуют время и дозо-зависимые эффекты TGF-я на ЭМТ и сократительность клеток. В этой статье мы демонстрируем полезность этого подхода, измеряя изменения в контрактности во время индуцированной EMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для успеха этого метода, очень важно иметь равномерно покрытый образец с постоянной толщиной около 100 мкм. Модули должны быть тщательно отобраны для изучения физической значимости биологической системы интересов. При изготовлении верхнего слоя, концентрация фидуциальных флуоресцент?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Тома Кодгера, Майкла Лэндри и Кристофера Барретта за помощь в синтезе биса. A.J.E. признает гранты Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям RGPIN/05843-2014 и E-PE/472339-2015, Канадские институты исследований в области здравоохранения No 143327, Грант Канадского онкологического общества No 703930 и Канадский фонд инноваций Проект #32749. Р. Кришнан признает, национальные институты здравоохранения грант нет. R21HL123522 и R01HL136209. H.Y. была поддержана Фондами де Рехерче Санте Квебеки и Fonds de recherche Nature et Technologies Квебека. Авторы благодарят Johanan Idicula за помощь в видео и рукописи и Зиксин Он за помощь в подготовке видео.
Materials
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP | |
References
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. Traction forces in locomoting cells. Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells. Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).
- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
