PDMS kullanarak yüksek verim çekiş kuvveti mikroskobu dönüşüm büyüme faktörü-β epitelyal-mezenkimal geçiş üzerinde doz bağımlı etkileri ortaya çıkarır
Summary
Biz silikon kauçuk (PDMS) ile imal yüksek verim çekiş kuvveti tahlil sunuyoruz. Bu roman tahlil çeşitli biyolojik ve Biyomedikal süreçler ve hastalıklar sırasında hücre kontrazlığı fiziksel değişiklikler okumak için uygundur. Bu yöntemin yardımcı programını, epitelyal-mesenkimal geçiş sırasında bir TGF-β bağımlılık artışına göre ölçerek gösteriyoruz.
Abstract
Hücresel contrility biyoloji çeşitli yönleri, motilsiyon ve bölme, doku kasılma ve mekanik stabilite ve çoklu hücresel hayvan yaşamının temel bir unsuru temsil eden sürüş süreçleri esastır. Yapışma hücrelerinde, hücrelerin substrat üzerinde oluşturan çekiş kuvvetlerinde ACTO-miyosin kasılma görülür. Hücresel kontrazlığın disyönetmeliği, sayısız patolojinin içinde görülür ve biyofizik kullanarak çeşitli tanı yaklaşımlarındaki kontrazlık, ölçüm olarak tanısal bir hedef haline gelmektedir. Dahası, yeni terapötik stratejiler hücre kontrazlığı belirgin arızayı düzeltmek dayalı olabilir. Ancak bu uygulamalar, bu kuvvetlerin doğrudan ölçülmesini gerektirir.
Paraleli Multi-Well formatında silikon elastomer bazlı çekiş kuvveti mikroskobu (TFM) geliştirdik. Silikon kauçuk kullanımı, özellikle polydimetilsiloxane (PDMS), yaygın olarak kullanılan hidrojel Poliakrilamid yerine (PAA) bize hiçbir özel depolama koşulları gerektiren belirsiz raf hayatları ile sağlam ve İnert Substratlar yapmak sağlar. GPa aralığında bir modülere sahip Pillar-PDMS tabanlı yaklaşımlar aksine, PDMS burada kullanılan çok uyumlu, yaklaşık 0,4 kPa 100 kPa kadar. Bu büyük monolitik alt yüzeylerden biyokimyasal bağımsız kuyulara bölünerek, mevcut Multi-Well sistemlerle uyumlu çekiş kuvveti taraması için çok iyi bir platform oluşturarak TFM için yüksek verim platformu oluşturacağız.
Bu yazıda, epitelyal mesenkimal geçişi (EMT) incelemek için bu çok iyi çekiş kuvveti sistemini kullanıyoruz; NMuMG hücrelerinde EMT ‘yi TGF-β ‘ a göstererek ve EMT sırasında Biyofizik değişikliklerin ölçülmesine neden oluyoruz. Biz konsantrasyon ve TGF-β maruz kalma süresi bir fonksiyon olarak kontrazlık ölçmek. Burada Bulgularımız hastalık Biyofizik bağlamında parallelized TFM yarar göstermektedir.
Introduction
ACTO-miyosin kontrazlığı, aktif hücre mekaniğinin temel bir unsurudur, motilite ve proliferasyon hücre davranışlarını etkileyen kök hücre farklılaşma. Dokularda, kontraksiyonda embriyogenin Polar ayrılması, hava yolu daralma ve kardiyak aktivite için aktivite sürücü. Kritik olarak, gerginlik oluşturmak için, hücreler önce kendi hücre içi çevreye uymalıdır. Bu sayede, bu kontraksiyonda çevrede çekiş kuvvetleri oluşturulur. Çekiş kuvveti mikroskopisi (TFM) farklı koşullarda çeşitli hücrelerden bu güçleri ölçmek için bir yol olarak formları çok sayıda ortaya çıkmıştır.
TFM ‘nin alanında olağanüstü bir yenilik ve uygulama genişliği görüldü ve sonuçlar, mekaniği ve fiziksel güçleri birleştiren biyolojide yeni perspektiflerin yolunu açtı. Kırışıklıklar silikon substratlar ile başlayan1, araştırmacılar hücre çekiş kuvvetleri ölçmek için çeşitli teknikler uyguladıysanız. Bu yaklaşımlar sürekli geliştirilmiş ve şimdi birkaç mikron sipariş üzerinde bir çözünürlük düzeyine ulaştı2. Ancak, bir asıl sorun ortaya çıkmıştır, kullanılabilir silikonları kullanarak uygun düşük Moduli substratlar oluşturma zorluk olduğunu. Bu sorunu aşmak için, poliakrilamid 1-20 kPa3sırasına göre substratlar oluşturma kolaylığı nedeniyle bir yedek olarak kabul edildi. Son zamanlarda TFM4‘ te çok uyumlu Silikonlar uyguladık, polyacrylamid olarak aynı Moduli yelpazesini üretmemize izin verdik, ancak inert ve sağlam silikon avantajları ile.
TFM yaklaşımlar değerli mechano-biyolojik keşifler etkin, ancak, kalıcı bir eksikliğinin karmaşıklığı, genellikle mühendislik veya Fizik Bilimleri disiplinlerinde araştırmacılar için kullanımını kısıtlayarak. Bu, kontrazlığı ölçmek için gerekli olan ayrıntılı Kalibrasyonlar ve zorlu hesaplamalar için büyük bir kısmı nedeniyle. Başka bir önemli zorluk TFM yöntemleri büyük ölçüde düşük verim ve bu nedenle kötü birçok farklı koşullar veya nüfus aynı anda5çalışmak için uygun olmasıdır. Bu, TFM ‘nin uzman bir Biyofizik ayarından daha geniş biyolojik ve farmakolojik uygulamalara transferini engelleyen bir darboğaz sundu.
Son zamanlarda, araştırmacılar, farklı bileşiklerin etkisini keşfetme ve aynı zamanda daha az reaktifleri kullanarak kendi TFM ölçümleri daha hızlı kontraktiflik ölçümleri için parallelize sağlar çok iyi Format TFM plaka, geliştirdik4 . Bu metodoloji, bileşiklerin hücresel aktivite üzerindeki etkilerini değerlendirerek, farklılaşma veya hastalıkta kontril değişikliklerin ölçülmesi için çeşitli mechanobolojik çalışmalarda geniş bir yardımcı programdır.
TFM ‘den büyük avantaj sağlayacak Biyomedikal araştırmanın bir alanı, fiziksel ipuçların kanser hücrelerinin malign fenotiplerini nasıl etkilediğini incelemektir. Kansere bağlı ölümlerin% 90 ‘ inden sorumlu metasjen, orijinal tümör yerlerini bırakarak ve ikincil bir site kolonize edilen kanserli hücreler ile karakterize edilir. Hücreler doku üzerinden göç ve vasküler sistem içinde ve dışına geçmek için, onlar radikalli matris ya da diğer arasında hareket onların yolunu çekmek için önemli güçler oluştururken bu fiziksel engelleri sıkmak için şekillerini değiştirmek gerekir Hücre. Bu kuvvetler odak yapışma etkileşimleri ile substrat aktarılır2,3, ve TFM kullanılarak nicelik olabilir. Kanser biyokimyasal olarak son derece çeşitlidir, bilinen mutasyonlar ve protein değişimleri genişleyen repertuarı ile, bazı yaygın fiziksel değişiklikler gözlenmiştir; kanser çeşitli, meme, prostat ve akciğer kanserleri de dahil olmak üzere, metastatik hücreler 2-3 kez olmayan metastatik hücrelerin çekiş kuvvetleri6,7,8uygulamak gösterildi. Bu sonuçlar, metastatik progresyon ve hücreler tarafından uygulanan çekiş kuvvetleri arasında güçlü bir korelasyon olabilir; Ancak, kontrazlık ayrıntılı zaman bağımlı değişiklikler incelemek zordur.
Epitelyal-mesenkimal geçiş (EMT), hücreler, daha fazla göç ve invazif hale gelen, bağlı ve sıkı kavşak aracılı hücre hücresi yapışma azaltmak bir süreçtir. Yara iyileşmesi ve gelişimsel süreçler içeren fizyolojik fonksiyonlara ek olarak, EMT aynı zamanda metastani sırasında sömürülen bir süreçtir ve bu işlem için yararlı bir model sistemi haline gelmiştir. TGF-β kullanarak, bu dönüşüm sırasında fiziksel değişiklikleri doğrudan ölçmek için murine meme epitelyal hücrelerde (nmumg)9 ‘ da EMT ‘i teşvik edebilir ve TGF-β ‘ n i n EMT ve hücre kontraktifinde zaman ve doza bağımlı etkilerini karakterize edersiniz. Bu yazıda, indüklenen EMT sırasında kontrazlık değişikliklerini ölçerek bu yaklaşımın yardımcı programını gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntemin başarısı için, yaklaşık 100 μm sabit kalınlığına sahip homojen kaplanmış bir numune olması önemlidir. Modüle, ilgi biyolojik sisteminin fiziksel önemini incelemek için dikkatle seçilmelidir. Bir üst tabaka imal ettiğinde, fiducial floresan partiküllerinin konsantrasyonu, deplasman ve çekiş stresi doğru analizi için optimize edilmelidir. Yalıtılmış tek hücreleri analiz etmek, konfluent monolayerlerin ölçülmesine göre daha yoğun bir Mütevelli tabakası gerektirir. Ayrıca, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar boncuk sentezi ile yardım için Tom Kodger, Michael Landry ve Christopher J. Barrett teşekkür ederiz. A.J.E., Doğal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi ‘Nin RGPIN/05843-2014 ve EQPEQ/472339-2015, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri No. 143327, Kanadalı Kanser Derneği Grant No. 703930 ve Kanadalı Inovasyon Vakfı Hibe eder. Proje #32749. R. kurt, Ulusal Sağlık Enstitüleri No. R21HL123522 ve R01HL136209. H.Y. Fonds de Recherche Santé Québec ve Fonds de Recherche doğa et Technologies Québec tarafından desteklenmektedir. Yazarlar video ve el yazması ve Zixin o video hazırlama yardım için yardım için Johanan IULA teşekkür ederiz.
Materials
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP | |
References
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. Traction forces in locomoting cells. Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells. Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).
- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
