Un modelo de ratón ortotópico inducido por hepatocitos oncogénicos que surge en el ajuste de la inflamación hepática y la fibrosis
Summary
Aquí, describimos el desarrollo de un modelo murino clínicamente relevante de cáncer de hígado recapitulando las características inmunitarias típicas del cáncer hepatocelular (HCC).
Abstract
La ausencia de un modelo animal clínicamente relevante que aborde las características inmunitarias típicas del cáncer hepatocelular (HCC) ha impedido significativamente el esclarecimiento de los mecanismos subyacentes y el desarrollo de estrategias inmunoterapéuticas innovadoras. Para desarrollar un modelo animal ideal recapitulando HCC humano, los ratones machos inmunocompetentes C57BL/6J reciben primero una inyección de tetracloruro de carbono (CCl4) para inducir fibrosis hepática, luego reciben hepatocitos oncogénicos histológicamente normales de machojoven joven Ratones transgénicos de antígeno SV40 T (TAg) (MTD2) por inoculación intraesplénica (ISPL). Los andrógenos generados en ratones machoreceptores en la pubertad inician la expresión de TAg bajo el control de un promotor específico del hígado. Como resultado, los hepatocitos transferidos se convierten en células cancerosas y forman masas tumorales en el entorno de la fibrosis/cirrosis hepática. Este novedoso modelo imita la iniciación y progresión humana de hCC en el contexto de la fibrosis/cirrosis hepática y refleja las características más típicas de la HCC humana, incluida la disfunción inmune.
Introduction
El cáncer hepatocelular (HCC) es el tipo de cáncer que aumenta más rápidamente en los Estados Unidos (EE.UU.)1,2,3. Cada año, aproximadamente 850.000 nuevos casos se diagnostican4,5 y 700.000 pacientes mueren a causa de esta enfermedad letal6,7,8,9,10 , lo que la convierte en la segunda causa más alta de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. El manejo de HCC incluye resección quirúrgica, trasplante, ablación, quimioembolización o terapias sistémicas, como sorafenib11. El diagnóstico y el manejo tempranos con resección quirúrgica o trasplante tienen el mayor beneficio de supervivencia global4. Desafortunadamente, la mayoría de los pacientes se presentan en una etapa posterior y requieren tratamiento con ablación, quimioembolización o sorafenib12. Sorafenib, un inhibidor receptor de tirosina quinasa (RTKI), fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos en 2008 como la única terapia de medicamentos sistémicos disponible para el tratamiento de HCC no resecable. Aunque el fármaco sólo proporciona un aumento modesto en la supervivencia global, de 7.9 a 10.7 meses13, proporcionó una nueva estrategia terapéutica que podría ser utilizado para manejar HCC.
Manipular el sistema inmunitario para eliminar los cánceres establecidos es un campo de rápido crecimiento en la investigación del cáncer14. Los estudios de punto de control inmune han avanzado considerablemente el desarrollo de fármacos inmunoterapéuticos en el tratamiento del cáncer15,16. La FDA aprobó el uso de anticuerpos (Abs) contra el antígeno t-linfocitos T citotóxico 4 (CTLA-4), la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1), y su ligando PD-L1 para el tratamiento del melanoma, el cáncer de pulmón, el cáncer de cabeza y cuello, y el cáncer de vejiga17, 18 , 19 , 20. Los ensayos clínicos de monoterapia o terapia combinada con uno o varios anticuerpos contra PD-1, PD-L1 o CTLA-4 para el tratamiento de la HCC avanzada están en curso21,22,23,y algunos ensayos han mostrado resultados favorables. En 2017, la FDA otorgó la aprobación acelerada para el anticuerpo anti-PD-1 para tratar a los pacientes con HCC, que son resistentes a sorafenib, pero la tasa de respuesta general de esta terapia es de sólo 14.3%. Otras estrategias no se han traducido en la práctica clínica en este momento24,25. Superar la tolerancia inmune profunda inducida por tumores para mejorar la terapia de punto de control inmune26; predecir la eficacia de la terapia de punto de control inmune; prevenir eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario; optimizar la ruta de administración, la dosis y la frecuencia; y encontrar combinaciones efectivas de terapias27,28,29 siguen siendo tareas extremadamente desafiantes.
Hay varios enfoques convencionales utilizados para inducir HCC en modelos de ratón actualmente y se utilizan dependiendo de la pregunta de investigación particular del investigador30. Los modelos de ratón HCC inducidos químicamente con compuestos genotóxicos imitan la neoplasia maligna inducida por lesiones. Los modelos de xenoinjerto a través de la implantación ectópica u ortotópica de líneas celulares HCC son adecuados para la detección de fármacos. Varios ratones modificados genéticamente han sido diseñados para investigar la fisiopatología del HCC. Los ratones transgénicos que expresan genes virales, oncogenes y/o factores de crecimiento permiten la identificación de las vías implicadas en la hepatocarcinogénesis. Debido a las limitaciones inherentes, estos modelos no recapitulan las características inmunitarias típicas que se ven en el HCC humano, lo que ha impedido significativamente el esclarecimiento de los mecanismos subyacentes y el desarrollo de estrategias inmunoterapéuticas innovadoras14 ,15. Recientemente hemos creado un modelo murino clínicamente relevante. Este nuevo modelo no sólo imita la iniciación y progresión humana de HCC, sino que también refleja las características más típicas de la enfermedad humana, incluida la disfunción inmune. Hemos caracterizado sus características biológicas e inmunológicas. Aprovechando este novedoso modelo, hemos explorado diversas estrategias inmunoterapéuticas para tratar HCC31,32,33,34,35,36, 37. Esta plataforma única nos permite estudiar mecanismos de inmunotolerancia inducida por tumores y desarrollar estrategias terapéuticas de prueba de concepto para HCC hacia la posterior traducción clínica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con este protocolo, hemos establecido un modelo murino fiable y reproducible de HCC que imita la iniciación y progresión humana de HCC. Clínicamente, muchos factores de riesgo inducen sucesivamente lesiones hepáticas, fibrosis hepática, cirrosis y la etapa final del HCC. En nuestro protocolo, la inyección IP de CCl4 se utiliza primero para producir fibrosis hepática en ratones de tipo salvaje, lo que permite que los posteriores hepatocitos oncogénicos formen los tumores en el entorno de la fibrosis hep…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo cuenta con el apoyo de NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O’Carroll, PI) y NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu Li, Kevin F. Staveley-O’Carroll).
Materials
| Anesthesia machine | VETEQUIP | IMPAC6 | anesthesia machine for surgery |
| Butterfly needle | BD | 8122963 | Needle used for liver perfusion |
| C57BL/6 mice | Jackson Lab | 000664 | mice used in prototol |
| Carprofen | CRESCENT CHEMICAL | 20402 | carprofen for pain release |
| Cell Strainer | CORNING | REF 431751 | Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | centrifuge for cell isolation |
| Clips | Teleflex Medical | REF 523700 | Titanium Clips for spleen |
| Microscope | Zeiss | Primovert | microscope for cell observation |
| Mtd2 mice | N/A | Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab | |
| Needle | BD | REF 305109 | BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm) |
| Suture | ETHICON | J303H | coated VICRYL suture |
| SV40 T Ag antibody | Abcam | ab16879 | anti-SV40 T-antigen antibody for IHC |
| Syringe | BD | REF 309626 | 1 mL TB syringe for cell injection |
| Trypan blue | SIGMA | T 8154 | Trypan blue solution for cell viability test |
| Wound clips | Reflex | reflex9, Part. No. 201-1000 | stainless steel wound clips for wound close |
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