Imagerie confocale direct des méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes
Summary
Ce protocole présente comment vivre image et analyser les méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser.
Abstract
Les fonctions de méristème apical (SAM) pousse comme un réservoir des cellules souches conservées et il génère presque tous les tissus hors sol pendant le développement post-embryonnaire. L’activité et la morphologie des SAMs déterminent des caractéristiques agronomiques importants, tels que l’architecture de shoot, taille et nombre d’organes reproducteurs et surtout, le rendement en grain. Ici, nous fournissons un protocole détaillé permettant d’analyser aussi bien la morphologie de la surface et la structure cellulaire interne du vivant SAMs provenant de différentes espèces par le biais de microscope confocal à balayage laser. Tout le processus depuis la préparation de l’échantillon à l’acquisition d’images de haute résolution en trois dimensions (3D) peut être accompli au sein aussi court que 20 minutes. Nous démontrons que ce protocole est très efficace pour l’étude non seulement l’inflorescence SAMs de l’espèce modèle, mais aussi les méristèmes végétatives de différentes cultures, fournissant un outil simple mais puissant pour étudier l’organisation et le développement de méristèmes dans différentes espèces de plantes.
Introduction
Le méristème de la plante contient un réservoir de cellules souches indifférenciées et maintient en permanence la croissance des organes végétaux et développement1. Pendant le développement post-embryonnaire, presque tous les tissus hors sol d’une plante sont dérivés de méristème apical (SAM). Dans les cultures, l’activité et la taille de la SAM et ses dérivées méristèmes floraux sont étroitement associées aux nombreuses caractéristiques agronomiques telles que shoot architecture, production de fruits et rendement en graines. Par exemple, chez la tomate, un SAM élargi entraîne une augmentation de la pousse et l’inflorescence ramification et donc des résultats dans la production d’appoint fleurs et fruits organes2. Chez le maïs, une augmentation de taille de SAM mène à un plus grand nombre de graines et le rendement total3,4. Chez le soja, l’indétermination de méristème est également étroitement associée à l’architecture de shoot et rendement5.
La morphologie et l’anatomie de SAMs peuvent être caractérisés par plusieurs méthodes différentes, y compris la coupe/coloration histologique et le scanning electron microscopy (SEM)6, qui ont grandement contribué à améliorer la recherche de méristème en fournissant la vue en coupe ou une vue de surface tridimensionnelle (3D) de SAMs. Toutefois, les deux méthodes prennent beaucoup de temps, impliquant plusieurs étapes expérimentales de la préparation de l’échantillon à l’acquisition de données, et ces méthodes dépendent principalement des échantillons fixes. Les progrès récents en microscopie confocale à balayage laser ont réussi à surmonter ces limitations et nous fournissent un outil puissant pour étudier la structure cellulaire et les processus de développement de l’usine tissus et organes7,8. Par optique plutôt que le tissu physique sectionnement, confocale microscopie permet la collecte d’une série d’images de z-pile et la reconstruction 3D subséquente de l’échantillon par le biais de logiciels d’analyse image.
Ici, nous décrivons une procédure efficace pour étudier à l’intérieur et des structures superficielles des vivants SAMs de différents plant des essences à l’aide de laser, microscopie confocale, qui potentiellement permet aux chercheurs d’accomplir tous les expérimentale processus au sein aussi court que 20 minutes. Différente des autres méthodes publiées pour l’imagerie confocale direct d’Arabidopsis inflorescence SAMs9,10,11,12,13,14, 15 et Arabidopsis fleurs12,13, nous démontrons que ce protocole est très efficace pour l’étude non seulement les méristèmes d’inflorescence de l’espèce modèle mais aussi de la pousse végétative méristèmes apicaux de différentes cultures, telles que la tomate et le soja. Cette méthode ne repose pas sur des marqueurs fluorescents transgéniques et peut potentiellement être appliquée afin d’étudier les méristèmes de beaucoup de différentes espèces et cultivars. En outre, nous présentons également l’étapes permettant d’afficher et d’analyser les différentes SAMs dans une vue 3D de traitement d’image simple. Pris ensemble, cette méthode simple facilitera les chercheurs à mieux comprendre la structure et le processus de développement des méristèmes d’organismes modèles et des récoltes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici une méthode d’imagerie simple qui peut être appliquée à l’étude des méristèmes apicaux de différentes plantes avec une modification mineure, ouvrant une nouvelle voie pour étudier la régulation de méristème à des stades végétatifs et reproducteurs de plantes modèles et cultures. Contrairement à la SEM et les méthodes de coloration histologiques, ce protocole peut aider à révéler la surface vue tant les structures cellulaires internes des SAMs, sans la nécessité d’une fixat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Purdue Bindley Bioscience Center Imaging Facility pour accéder aux microscope confocal à balayage laser et le support technique, et les auteurs apprécient l’aide de Andy Schaber dans les installations d’imagerie Purdue Bindley. Cette activité a été financée par l’Université de Purdue dans le cadre du carrefour de AgSEED pour soutenir l’Agriculture et du développement Rural de l’Indiana.
Materials
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Use as making MS plates |
| Plastic petri dishes60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Use as imaging dishes |
| Propagation Mix | Sungro Horticulture | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| Razor blade | PERSONNA | 62-0179 | For cutting shoot apex from plants |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Image acquisition software |
References
- Meyerowitz, E. M. Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell. 88 (3), 299-308 (1997).
- Xu, C., et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).
- Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus. Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).
- Je, B. I., et al. Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits. Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).
- Ping, J., et al. Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean. Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).
- Vaughan, J. G., Jones, F. R. Structure of the angiosperm inflorescence apex. Nature. 171, 751 (1953).
- Sijacic, P., Liu, Z. Novel insights from live-imaging in shoot meristem development. Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).
- Tax, F. E., Durbak, A. Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems. Plant Cell. 18 (6), 1331 (2006).
- Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem. Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).
- Prunet, N. Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers. Journal of Visualized Experiments. (122), e55156 (2017).
- Prunet, N., et al. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. 발생학. 419, 114-120 (2016).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131, 4225-4237 (2004).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 773 (2017).
- Zhou, Y., et al. HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers. Science. 361 (6401), 502-506 (2018).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases. Development. 142 (6), 1043 (2015).
- Li, W., et al. LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation. Science Signaling. 6 (270), ra23 (2013).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
