AC confocal Live bildebehandling av skyte apikal Meristems fra forskjellige plantearter
Summary
Denne protokollen presenterer Hvordan leve bilde og analysere skyte apikal meristems fra forskjellige plantearter bruker laserskanning AC confocal mikroskopi.
Abstract
Den skyte apikal meristem (SAM) fungerer som et bevart stamcelleforskningen reservoar og det genererer nesten alle aboveground vev under postembryonic utviklingen. Aktivitet og morfologi av SAMs bestemmer viktig Agronomisk trekk, som skyter arkitektur, størrelse og reproduktive organer, og viktigst, korn avkastning. Her gir vi en detaljert protokoll for å analysere både overflaten morfologi og den interne cellestruktur levende SAMs fra ulike arter gjennom laserskanning AC confocal mikroskop. Hele prosedyren fra prøven forberedelse til anskaffelsen av høy oppløsning tredimensjonalt (3D) bilder kan gjøres innen idet kort idet 20 minutter. Vi viser at denne protokollen er svært effektiv for å studere ikke bare sitter SAMs modell arter, men også de vegetative meristems fra ulike avlinger, gir en enkel, men kraftig verktøy for å studere organisasjon og utvikling av meristems over forskjellige plantearter.
Introduction
Anlegget meristem inneholder en pool av udifferensierte stamceller og kontinuerlig opprettholder anlegget orgel vekst og utvikling1. Under postembryonic utvikling stammer nesten alle aboveground vev av en plante fra skyte apikal meristem (SAM). I avlinger er aktivitet og størrelsen på SAM og dens avledede floral meristems tett forbundet med mange Agronomisk trekk som skyte arkitektur, frukt produksjonen og frø avkastning. For eksempel i tomat forårsaker et forstørret SAM en økning i skyte- og sitter ved, og dermed resulterer i generere ekstra blomst og frukt organer2. I mais fører en økning i SAM størrelse til et høyere frø og totale avkastning3,4. I soyabønner, meristem indeterminacy er også nært forbundet med skyte arkitektur og gi5.
Morfologi og anatomi av SAMs kan være preget av flere forskjellige metoder, inkludert histologiske skjæring/flekker og skanning elektronmikroskop (SEM)6, begge har stor avansert meristem forskning gjennom å gi enten inndelingsvisning eller tredimensjonale (3D) overflate utsikt over SAMs. Men begge metodene er tidkrevende, som involverer flere eksperimentelle skritt fra eksempler forberedelse til datainnsamling, og disse metodene avhenger hovedsakelig fast prøver. Nylige fremskritt innen laserskanning AC confocal mikroskopi teknikken har overvinne disse begrensningene og gi oss et kraftig verktøy for å undersøke mobilnettet strukturen og utviklingsprosess anlegget vev og organer7,8. Gjennom optiske enn fysisk vev snitt, AC confocal mikroskopi kan en rekke z-stakk bilder og påfølgende 3D rekonstruksjon av utvalget gjennom analyseprogramvare.
Her beskriver vi en effektiv fremgangsmåte for å undersøke både i og overflate strukturer levende SAMs fra forskjellige plantearter bruker laserskanning AC confocal mikroskopi, som potensielt gir forskere å utføre alle den eksperimentelle behandle innenfor så kort som 20 minutter. Forskjellig fra andre publiserte metoder for live AC confocal bildebehandling av Arabidopsis sitter SAMs9,10,11,12,13,14, 15 og Arabidopsis blomster12,13, her viser vi at denne protokollen er svært effektiv for å studere ikke bare de sitter meristems modell arter, men også vegetative skyte apikal meristems fra ulike avlinger, som tomat og soyabønner. Denne metoden er avhengig ikke av transgene fluorescerende markører, og potensielt kan brukes for å studere skyte meristems fra mange ulike arter og kultivarer. Dessuten, introdusere vi også den enkel bildebehandlingen trinnene for å vise og analysere ulike SAMs i en 3D-visning. Samlet vil denne enkle metoden lette forskere bedre forstå både i struktur og utviklingsprosessen av meristems fra både modell organismer og avlinger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en enkel bildebehandling metode som kan brukes til studiet av skyte apikal meristems fra ulike anlegg med mindre endring, åpne en ny vei å studere meristem regulering på både vegetative og reproduktive stadier i modellen planter og avlinger. I motsetning til SEM og histologiske flekker metoder, kan denne protokollen bidra til å avsløre både overflaten visning og interne cellulære strukturer i SAMs, uten behov for arbeidskrevende eksempel fiksering og/eller vev snitting trinnene. Denne protokollen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner Purdue Bindley Bioscience Center Imaging anlegg for tilgang til laserskanning AC confocal mikroskop og teknisk støtte, og forfatterne takker hjelp fra Andy Schaber i Purdue Bindley Imaging anlegget. Denne aktiviteten ble finansiert av Purdue University som en del av AgSEED Crossroads finansiering for å støtte Indianas jordbruk og jordbruksutvikling.
Materials
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Use as making MS plates |
| Plastic petri dishes60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Use as imaging dishes |
| Propagation Mix | Sungro Horticulture | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| Razor blade | PERSONNA | 62-0179 | For cutting shoot apex from plants |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Image acquisition software |
References
- Meyerowitz, E. M. Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell. 88 (3), 299-308 (1997).
- Xu, C., et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).
- Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus. Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).
- Je, B. I., et al. Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits. Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).
- Ping, J., et al. Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean. Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).
- Vaughan, J. G., Jones, F. R. Structure of the angiosperm inflorescence apex. Nature. 171, 751 (1953).
- Sijacic, P., Liu, Z. Novel insights from live-imaging in shoot meristem development. Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).
- Tax, F. E., Durbak, A. Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems. Plant Cell. 18 (6), 1331 (2006).
- Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem. Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).
- Prunet, N. Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers. Journal of Visualized Experiments. (122), e55156 (2017).
- Prunet, N., et al. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. 발생학. 419, 114-120 (2016).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131, 4225-4237 (2004).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 773 (2017).
- Zhou, Y., et al. HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers. Science. 361 (6401), 502-506 (2018).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases. Development. 142 (6), 1043 (2015).
- Li, W., et al. LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation. Science Signaling. 6 (270), ra23 (2013).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
