Секвенирование наноруды является новой технологией, которая позволяет экономически эффективной последовательности в отдаленных местах и ресурсов бедных условиях. Здесь мы представляем протокол для секвенирования mRNAs из цельной крови, совместимый с такими условиями.
Секвенирование в удаленных местоположениях и в условиях нехватки ресурсов создает уникальные проблемы. Секвенирование наноруды может быть успешно использовано в таких условиях и было развернуто в Западной Африке во время недавней эпидемии вируса Эбола, подчеркивая эту возможность. В дополнение к практическим преимуществам (низкая стоимость, простота транспортировки и использования оборудования), эта технология также обеспечивает фундаментальные преимущества по сравнению со вторым поколением подходов секвенирования, особенно очень долго читать длина, способность непосредственно последовательности РНК и доступность данных в режиме реального времени. Сырая точность чтения ниже, чем при других платформах секвенирования, что представляет собой основное ограничение этой технологии; Однако, это может быть частично смягчено высокой глубиной чтения, генерируемой. Здесь мы представляем протокол, совместимый с полем для секвенирования mRNAs, кодирующего Ниманн-пика С1, который является сотовым рецептором эболавивирусов. Этот протокол включает в себя извлечение РНК из образцов крови животных, а затем РТ-СР для обогащения цели, штриховое кодирование, подготовка библиотеки, и последовательность запуска сам, и может быть легко адаптирована для использования с другими целями ДНК или РНК.
Секвенирование является мощным и важным инструментом в биологических и биомедицинских исследованиях. Он позволяет анализировать геномы, генетические вариации и профили РНК, и, таким образом, играет важную роль в расследовании заболеваний человека и животных, так1,2. Секвенирование Сэнгера, один из старейших методов секвенирования ДНК, до сих пор обычно используется по сей день и является угловым камнем молекулярной биологии. За последние 50 лет, эта технология была улучшена для достижения чтения длины более 1 000 NT и точность выше, чем 99,999%1. Однако секвенирование Сэнгера также имеет свои ограничения. Секвенирование большего набора образцов или анализ целых геномов с этим методом является трудоемким и дорогостоящим1,3. Методы секвенирования ДНК второго поколения, такие как 454 Пиросеквенирование и технология «Озарина», позволили нам значительно сократить затраты и рабочую нагрузку, необходимые для секвенирования в течение последнего десятилетия, и привели к огромному увеличению количество биологической последовательности информации, доступной4. Тем не менее, Индивидуальная секвенирование выполняется с использованием технологий второго поколения, и секвенирование в полевых условиях является сложным, так как необходимое оборудование громоздко и хрупко (аналогично устройствам секвенирования Сэнгера) и часто приходится быть откалиброван и обслуживается специально подготовленным персоналом. Кроме того, для многих из второго поколения технологии чтения длины довольно ограничены, что часто делает ниже по течению биоинформатики анализа этих данных сложной.
Секвенирование третьего поколения с использованием карманных устройств секвенирования наноруды (см. таблицу материалов) может послужить альтернативой этим установленным секвенированию платформ. В этих устройствах молекула одноцепочечной ДНК или РНК проходит через наноруду одновременно с ионного тока, который затем измеряется датчиком (Рисунок 1). По мере того как прядь пересекает наноруду, обнаруживается модуляция тока нуклеотидами, присутствния в поры в любой момент времени, и вычислительно назад-переведена в нуклеотидный последовательность5. Из-за этого оперативного принципа, секвенирование наноруды позволяет как поколения очень долго читает (близко к 1 х 106 нуклеотидов6) и анализ последовательности данных в режиме реального времени. Баркодирование возможно путем присоединения определенных последовательностей нуклеотидов к нуклеиновых кислот в образце, что позволяет анализировать несколько образцов в одном запуске последовательности, таким образом увеличивая пропускную способность выборки и понижая затраты на образец. Из-за высокой переносимости и простоты использования устройства для секвенирования наноруд успешно используются в полевых условиях в ходе недавней эпидемии болезни, вызванной вирусом Эбола, в Западной Африке, что подчеркивает их пригодность для быстрого развертывания в отдаленных регионах7 , 8.
Здесь мы описываем подробный протокол, совместимый с полем для секвенирования мРНК, кодирующего белок Ниманн-пика С1 (NPC1), который является облигатными рецептором для филовирусов, таких как эболавивирусы, и, как было доказано, ограничивает восприимчивость видов к Эти вирусы9,10. Протокол включает в себя извлечение всей РНК из образцов крови, специфическое усиление NPC1 мРНК путем RT-СР, баркокодирование образцов, подготовку библиотеки и секвенирование с устройством секвенирования наноруды. Анализ данных не может обсуждаться из-за ограниченности пространства, хотя в репрезентативных результатах представлены некоторые базовые указания; Тем не менее, заинтересованном читателю упоминается Предыдущая публикация11 для более подробного описания рабочего процесса, который мы использовали, а также публикаций других12,13,14 для детальной информации в отношении инструментов анализа, используемых в этом рабочем процессе.
За последние два десятилетия секвенирование биологических образцов стало все более важным аспектом исследований в широком диапазоне предметно-значимых областей. Разработка систем секвенирования второго поколения на основе последовательности плотных массивов ДНК с использованием итеративных циклов ферментативной манипуляции и сбора данных на основе изображений1 резко увеличила пропускную способность по сравнению с традиционного метода секвенирования Сэнгера, и позволяет анализировать несколько образцов, а также различные виды нуклеиновых кислот в данном образце параллельно4. Однако для большинства широко используемых систем второго поколения производится только короткое считывает, и все платформы полагаются на чувствительное, громоздкое и дорогостоящее оборудование3,4.
В отличие от платформ секвенирования второго поколения, используемое в данном протоколе устройство секвенирования основано на технологии наноруды. Здесь молекула одноцепочечной нуклеиновой кислоты проходит через наноруду, что приводит к модуляции ионного течения, которое также течет через те же наноруды, и которые могут быть измерены и обратно-перевод вывести последовательность молекулы нуклеиновой кислоты. Такой подход к секвенированию третьего поколения придает ряд преимуществ по сравнению с другими подходами. Основные преимущества, которые непосредственно связаны с уникальным рабочим принципом этой технологии являются чрезвычайно долго читать длина производства (читать длины до 8,8 х 105 нуклеотиды были зарегистрированы6), способность последовательности не только ДНК, но также РНК напрямую, которая недавно была продемонстрирована для полного генома вируса гриппа17, и способность анализировать данные в режиме реального времени, как они создаются, что позволяет быстрое метагеномики обнаружения патогенов в течение минут18. Дополнительными практическими преимуществами являются крайне небольшие размеры устройства секвенирования наноруд, позволяющие использовать его в любой лаборатории или на полевых миссиях в отдаленные места19,20, и низкую цену по сравнению с другими секвенированием Платформ. Что касается затрат на запуск, то в настоящее время для каждого запуска последовательности требуется новая ячейка потока, которая приводит к затратам в размере около $1 100 за пробег для реагентов по подготовке потока и библиотек. Эти затраты могут быть сокращены в некоторых случаях путем промывки и повторного использования ячейки потока, или путем штрихкодирования и секвенирования нескольких образцов в одном запуске. Кроме того, новый тип потока ячейки в настоящее время бета-тестирования небольшого числа лабораторий, которые потребуют использования адаптера ячейки потока (так называемый “flongle”), и должны значительно уменьшить расход ячейки цена и, таким образом, расходы.
Основные недостатки последовательности наноруды остается его точностью, с одним читать точности в диапазоне от 83 до 86% сообщается6,21,22, и большинство из неточностей, вызванных вставки/удалений ( indels)5,21. Тем не менее, высокая глубина чтения может компенсировать эти неточности, и недавнее исследование предложил на основе теоретических соображений, что чтение глубина > 10 может увеличить общую точность, чтобы > 99.8%21. Тем не менее потребуются дальнейшие улучшения в точности, особенно если анализ будет выполняться на одном уровне молекул, а не на уровне консенсусной последовательности. Использование технологии 1D2 , описанной в этом протоколе, основанный на добавлении адаптеров 1d2 и штрих-кодов (см. раздел 5,5), которые приводят к тому, что обе нити одной молекулы ДНК секвенированы одним и тем же наноштуф, увеличивает прочитанное точность, поскольку информация из обеих нитей ДНК может быть использована для определения последовательности. Кроме того, обходной стратегии, которые могут быть продолжены для того, чтобы объединить преимущества секвенирования наноруды (особенно долго читать длина) с более высокой точностью других технологий секвенирования является использование наноруды секвенирования информации как эшафот, который является затем полируется с помощью секвенирования данных с других платформ6.
Наиболее важным фактором успеха протокола, представленного здесь, является качество выборки и, в частности, количество и качество извлеченной РНК. Надлежащее хранение и быстрое извлечение РНК помогают в достижении адекватного выхода РНК. Использование надлежащих труб для сбора крови позволяет хранить пробы крови в течение одного месяца, но свертывание крови может быть проблемой, особенно когда образцы хранятся при повышенных температурах, которые могут быть в случае полевых условиях. Второй критический шаг является усиление целевых последовательностей, и особенно в полевых условиях, реакции ЦР часто выполняют менее хорошо, чем в стандартных лабораторных условиях7. С этой целью тщательное проектирование грунтовки и оптимизация имеет первостепенное значение для достижения надежного усиления. Кроме того, вложенные ЦР-подходы и СР-посадки, используемые в этом протоколе, могут увеличить как специфичность, так и чувствительность целевого амплификации генов4,7. В самом деле, по нашему опыту в Либерии и Гвинее с этой технологией вложенные протоколы требовались в полевых условиях с образцами полей даже для наборов грунтовки, которые позволяли усиления целевых показателей из лабораторных образцов и в лабораторных условиях с один раунд ЦР (7 и неопубликованные результаты).
В отличие от этих более критических шагов, подготовка библиотек и последовательность выполнения сами по себе являются довольно надежными процедурами. Однако в полевых условиях практические вопросы, такие, как наличие определенных единиц оборудования, могут быть проблематичными. Например, УФ-спектрофотометр необходим для определения концентраций ДНК до подготовки библиотеки образцов баркодированных. Однако, если такое устройство не будет доступно в полевых условиях, равное количество каждого образца может быть просто объединено, чтобы составить 45 мкл, необходимый для подготовки библиотеки, с различиями в образце входных материалах, которые обычно смягчаются большим количество считывает. Аналогичным образом, необходимость подключения к Интернету для выполнения секвенирования может быть проблемой, даже если базовый вызов больше не должен выполняться онлайн, но может быть выполнен локально; Однако, эта необходимость может быть удалена при определенных обстоятельствах производителем, если требуется.
Таким образом, представленный Протокол допускает относительно низкую стоимость секвенирования в местах, где отсутствует доступ к традиционному оборудованию секвенирования, в том числе в удаленных местах. Она может быть легко адаптирована к любой целевой РНК или ДНК, тем самым позволяя исследователям ответить на многочисленные биологические вопросы.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Элисон Гросет за критическое чтение рукописи. Эта работа была финансово поддержана федеральным министерством продовольствия и сельского хозяйства Германии (BMEL) на основе решения парламента Федеративной Республики Германия через Федеральное ведомство по сельскому хозяйству и продовольствию (BLE).
1D2 adapter, barcode adapter mix, ABB buffer, elution buffer, RBF buffer, LBB beads | Oxford Nanopore Technologies | SQK-LSK308 | 1D² Sequencing Kit |
blood collection tube with DNA/RNA stabilizing reagent | Zymo Research | R1150 | DNA/RNA Shield – Blood Collection Tube |
blunt/TA ligase master mix | New England Biolabs | M0367S | Blunt/TA Ligase Master Mix |
DNA-low binding reaction tube | Eppendorf | 30108051 | DNA LoBind Tube |
DNase buffer and DNase | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
flow cell | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN105.24 | flow cell R9.4 |
hot start high fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0493L | Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (500 U) |
magnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | Agencourt AMPure XP beads |
magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | DynaMag-2 Magnet |
nanopore sequencing device | Oxford Nanopore Technologies | – | MinION Mk 1B |
PCR barcoding kit | Oxford Nanopore Technologies | EXP-PBC001 | PCR Barcoding Kit I (R9) |
reverse transcriptase master mix | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
RNA purification spin column, DNA/RNA prep buffer, DNA/RNA wash buffer, DNase I, DNA digestion buffer | Zymo Research | R1151 | Quick-DNA/RNA Blood Tube Kit |
rotating mixer | ThermoFisher Scientific | 15920D | HulaMixer Sample Mixer |
Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0287S | LongAmp Taq 2X Master Mix |
Ultra II End-prep kit | New England Biolabs | E7546S | NEBNext Ultra II End-Repair/dA-tailing Modul |
UV spectrophotometer | Implen | – | NanoPhotometer |
vacuum manifold | Zymo Research | S7000 | EZ-Vac Vacuum Manifold |