Design von Cecal Ligation und Punktion und Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression
Summary
Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Messung von infektiösen Ergebnissen, die sekundären Krankenhausinfektionen im immunsuppressiven Zustand zugrunde liegen, indem sie zunächst Cecal-Ligations-/Punktionsmäuse einrichten und sie mit intranasalen Infektionen herausfordern, um ein klinisch relevantes Modell der Immunsuppressionssepsis zu erstellen.
Abstract
Sepsis, eine schwere und komplizierte lebensbedrohliche Infektion, ist durch ein Ungleichgewicht zwischen pro- und entzündungshemmenden Reaktionen in mehreren Organen gekennzeichnet. Mit der Entwicklung von Therapien überleben die meisten Patienten die hyperinflammatorische Phase, kommen aber zu einer immunsuppressiven Phase, die das Auftreten von Sekundärinfektionen erhöht. Daher ist ein verbessertes Verständnis der pathogenese zugrunde liegenden sekundären Krankenhaus-erworbenen Infektionen in der immunsuppressiven Phase während der Sepsis von enormer Bedeutung. Hier wird berichtet, dass ein Modell, um infektiöse Ergebnisse zu testen, indem Sie Doppelschlag-Infektionen bei Mäusen. Ein Standard-Chirurgisches Verfahren wird verwendet, um polymikrobielle Peritonitis durch Cecal Ligation und Punktion (CLP) zu induzieren, gefolgt von einer intranasalen Infektion von Staphylococcus aureus, um Einelungenentzündung zu simulieren, die bei der Immunsuppression auftritt, die häufig beobachtet wird bei septischen Patienten. Dieses duale Modell kann den immunsuppressiven Zustand widerspiegeln, der bei Patienten mit langwieriger Sepsis und Anfälligkeit für sekundäre Infektionen durch nosokomiale Lungenentzündung auftritt. Daher bietet dieses Modell einen einfachen experimentellen Ansatz zur Untersuchung der Pathophysiologie der Sepsis-induzierten sekundären bakteriellen Lungenentzündung, die für die Entdeckung neuartiger Behandlungen für Sepsis und ihre Komplikationen verwendet werden kann.
Introduction
Sepsis initiiert ein komplexes Zusammenspiel von wirt pro-inflammatorischen und entzündungshemmenden Prozessen und zeichnet sich durch eine hyperinflammatorische Reaktion und nachfolgende Immunfunktionsstörung1,2aus. Sepsis stellt eine globale Gesundheitspriorität dar und verursacht eine hohe Zahl von Todesfällen auf Intensivstationen (IKUs)3. Die Inzidenz von Sepsis wird auf über 30 Millionen Fälle weltweit pro Jahr geschätzt, mit Sterblichkeitsraten von bis zu 30% trotz Fortschritten im ICU-Management4,5. Im Jahr 2017 verabschiedete die Weltgesundheitsorganisation eine Resolution zur Verbesserung der Prävention, Diagnose und Desmanagement dieser tödlichen Krankheit5. Jüngste Studien haben jedoch gezeigt, dass der Tod nicht auf eine primäre Infektion bei schweren septischen Patienten zurückzuführen ist, sondern auf eine sekundäre nosokomiale Infektion (insbesondere Lungenentzündung), die durch Immunsuppression verursacht wird6,7 . Daher ist es dringend erforderlich, die Mechanismen zu verstehen, warum septische Patienten sekundäre Infektionen entwickeln und effektivere Behandlungen entdecken. Hierin wird ein duales Modell beschrieben, das auch als Double-Hit-Modell bekannt ist, um das immunsuppressive Phänomen bei Patienten mit langwieriger Sepsis zu untersuchen.
Als Goldstandard-Experimentalmodell in der Forschung an polymikrobiellen Sepsis ist Cecal Ligation und Punktion (CLP) eine Operation, die sich durch Cecumligation und Perforation auszeichnet, die zu polymikrobieller Peritonitis und Sepsisbeiträgt 8,9 . Der pathophysiologische Prozess und die Zytokinprofile sowie die Kinetik und Die Größe ähneln der klinischen Sepsis. Die Position der Ligation, die Nadelgröße, die für die Punktion verwendet wird, und die Anzahl der Cecal-Punktionen sind wichtige Faktoren, die die Sterblichkeit nach CLP beeinflussen.
Die nosokomiale Lungenentzündung ist die Hauptursache für die Sterblichkeit bei schwerkranken Patienten mit Sepsis. Die wichtigsten Arten von Organismen, die schwere Sepsis verursachen, sind Staphylococcus aureus (20,5%), Pseudomonas-Arten (19,9%), Enterobacteriacae (hauptsächlich E. coli, 16,0%) und Pilze (19%). In der Zwischenzeit deuten neuere Studien auf eine zunehmende Inzidenz von grampositiven Organismen hin, die heute fast so häufig sind wie gramnegative Infektionen3.
Die in diesem Protokoll beschriebene Methode beinhaltet CLP, das als “erster Treffer” durchgeführt wird, um subleelle polymikrobielle Peritonitis zu induzieren, die eine Immunsuppressionsbedingung manifestiert. Das Verfahren beinhaltet auch die nachfolgende intranasale Instillation von S. aureus als “zweiten Treffer”, um eine klinisch relevante Forschungsplattform zur Verfügung zu stellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Als Goldstandardmodell für die Sepsisforschung hat CLP eine Kombination aus drei Beleidigungen, darunter Gewebetrauma, das durch die Laparotomie verursacht wird, Nekrose aufgrund der Ligatur des Cecums und Infektionen als Folge einer mikrobiellen Leckage, die Peritonitis mit Translokation verursacht. von Bakterienin blut8 . Daher imitiert CLP die Komplexität menschlicher Sepsis besser als viele andere Modelle. Eine wesentliche Einschränkung des aktuellen CLP-Modells ist jedoch die Unfähigkeit,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grants R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01 und AI097532-01A1 an M. W. unterstützt. Die Kerneinrichtungen der University of North Dakota wurden durch NIH-Stipendien (INBRE P20GM103442 und COBRE P20GM113123) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch vom Key Program of National Nature Science Foundation of China (81530063) an Jianxin Jiang unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts. Wir danken Marvin Leier (Center for Rural Health, University of North Dakota) für das Video.
Materials
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
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