Дизайн Цекал Лигация и прокол и интраназальные инфекции Двойная модель сепсиса индуцированной иммуносупрессии
Summary
Этот протокол описывает методы для измерения инфекционных исходов, лежащих в основе вторичных больничных приобретенных инфекций в иммуносупрессивном состоянии, сначала путем создания цекальной перевязки / прокол амышки затем бросая им вызов с интраназальной инфекцией создать клинически актуальную модель иммуносупрессионного сепсиса.
Abstract
Сепсис, тяжелая и сложная инфекция, угрожающая жизни, характеризуется дисбалансом между про- и противовоспалительными реакциями в различных органах. С развитием терапии, большинство пациентов выжить гипервоспалительной фазы, но прогресс в иммуносупрессивной фазе, которая увеличивает появление вторичных инфекций. Таким образом, улучшение понимания патогенеза, лежащего в основе вторичных больничных инфекций в иммуносупрессивной фазе во время сепвамиза имеет огромное значение. Сообщается здесь модель для тестирования инфекционных исходов путем создания двойного хит атак у мышей. Стандартная хирургическая процедура используется для индуцирования полимикробного перитонита путем цекалья перегибания и прокола (CLP) и с последующим интраназальное инфекции золотистого стафилококка для имитации пневмонии, происходящих в подавлении иммунитета, что часто видели у больных септом. Эта двойная модель может отражать иммуносупрессивное состояние, возникающее у пациентов с затяжным сепсисом и восприимчивостью к вторичной инфекции от нозокомиальной пневмонии. Таким образом, эта модель обеспечивает простой экспериментальный подход для исследования патофизиологии сепсиса индуцированной вторичной бактериальной пневмонии, которые могут быть использованы для обнаружения новых методов лечения сепсиса и его осложнений.
Introduction
Сепсис инициирует сложное взаимодействие провоспалительных и противовоспалительных процессов ихарактеризуется гипервоспалительным ответом и последующей иммунной дисфункцией 1,2. Сепсис представляет собой глобальный приоритет в области здравоохранения и вызывает большое число смертей в отделениях интенсивной терапии (IcUs)3. Заболеваемость сепсисом, по оценкам, превышает 30 миллионов случаев заболевания во всем мире в год, при этом смертность превышает 30%, несмотря на успехи в управлении СИС4,5. В 2017 году Всемирная организация здравоохранения приняла резолюцию по совершенствованиюпрофилактики, диагностики и лечения этого смертельного заболевания 5. Тем не менее, недавние исследования показали, что смерть не является результатом первичной инфекции у тяжелых пациентов септика, а скорее от вторичной нозокомиальной инфекции (особенно пневмонии), вызванной иммуносупрессией6,7 . Поэтому срочно необходимо понять механизмы, почему у больных септом развивается вторичная инфекция, и открывать более эффективные методы лечения. Здесь описана двойная модель, также известная как модель с двойным ударом, для изучения иммуносупрессивного явления, происходящего у пациентов с затяжным сепсисом.
В качестве экспериментальной модели золотого стандарта в исследованиях полимикробного сепсиса, цекаляющей перевязки и прокола (CLP) является операция характеризуется перевязкой цекум и перфорации, которая способствует полимикробный перитонит и сепсис8,9 . Патофизиологический процесс и цитокин профили, наряду с кинетикой и величины, похожи на клинический сепсис. Положение перевязки, размер иглы, используемый для прокола, и количество чекал проколы являются основными факторами, которые влияют на смертность после CLP.
Нозокомиальная пневмония является основной причиной смертности среди тяжелобольных пациентов с сепсисом. Основным типом организмов, вызывающих тяжелый сепсис, являются золотистый стафилококк (20,5%), виды Pseudomonas (19,9%), Enterobacteriacae (в основном кишечная палочка,16,0%), и грибы (19%). Между тем, последние исследования показали, увеличение заболеваемости грамположительных организмов, которые в настоящее время почти так же распространены, как грамотрицательные инфекции3.
Метод, описанный в этом протоколе включает CLP, выполняется в качестве “первого удара”, чтобы вызвать субсмертельный полимикробный перитонит, который проявляется состояние иммуносупрессии. Процедура также включает в себя последующее интраназальное заготворение S. aureus в качестве “второго удара”, чтобы обеспечить клинически соответствующую исследовательскую платформу.
Protocol
Representative Results
Discussion
В качестве золотой стандартной модели для исследования сепсиса, CLP имеет сочетание трех оскорблений, в том числе травмы тканей, вызванные лапаротомией, некрозом из-за перевязки цекума и инфекции в результате утечки микробов, которая вызывает перитонит с транслокацией бактерий в кровь<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения Гранты R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01, и AI097532-01A1 м. В. Основные объекты Университета Северной Дакоты были поддержаны грантами NIH (INBRE P20GM103442 и COBRE P20GM113123). Эта работа была также поддержана ключевой программой Национального фонда науки природы Китая (81530063) для Цзяньсин Цзяньцзян. Спонсоры не принимали никакого значения в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Мы благодарим Марвина Лейера (Центр сельского здравоохранения, Университет Северной Дакоты) за создание видео.
Materials
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Delano, M. J., Ward, P. A. The immune system’s role in sepsis progression, resolution, and long-term outcome. Immunological Reviews. 274 (1), 330-353 (2016).
- Mayr, F. B., Yende, S., Angus, D. C. Epidemiology of severe sepsis. Virulence. 5 (1), 4-11 (2014).
- Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).
- Reinhart, K., et al. Recognizing Sepsis as a Global Health Priority – A WHO Resolution. The New England Journal of Medicine. 377 (5), 414-417 (2017).
- Boomer, J. S., et al. Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure. JAMA. 306 (23), 2594-2605 (2011).
- Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 862-874 (2013).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis?. Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Hugunin, K. M. S., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34 (3), 250-260 (2010).
- He, S., et al. Annexin A2 Modulates ROS and Impacts Inflammatory Response via IL-17 Signaling in Polymicrobial Sepsis Mice. PLoS Pathogens. 12 (7), 23 (2016).
- Pu, Q. Q., et al. Atg7 Deficiency Intensifies Inflammasome Activation and Pyroptosis in Pseudomonas Sepsis. Journal of Immunology. 198 (8), 3205-3213 (2017).
- Zanotti-Cavazzoni, S. L., et al. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Medicine. 35 (4), 748-754 (2009).
- Chin, W., et al. A macromolecular approach to eradicate multidrug resistant bacterial infections while mitigating drug resistance onset. Nature Communications. 9 (1), 917 (2018).
- Nascimento, D. C., et al. IL-33 contributes to sepsis-induced long-term immunosuppression by expanding the regulatory T cell population. Nature Communications. 8, 14919 (2017).
- Deng, D., et al. Systematic investigation on the turning point of over-inflammation to immunosuppression in CLP mice model and their characteristics. International Immunopharmacology. 42, 49-58 (2017).
