التصور جيرمينوسوميس و "الغشاء الداخلي" في الجراثيم العصوية نجحت
Summary
كتلة بروتينات مستقبلات جيرمينانت في ‘جيرمينوسوميس’ في الغشاء الداخلي للجراثيم العصوية نجحت . يمكننا وصف بروتوكول باستخدام القرار سوبر مجهرية وفلوري البروتينات مراسل لتصور جيرمينوسوميس. ويحدد البروتوكول أيضا مجالات الغشاء الداخلي بوغ ملطخة تفضيلي مع صبغ الغشاء FM4-64.
Abstract
الحجم الصغير للجراثيم ووفرة منخفضة نسبيا من البروتينات الإنبات، يسبب صعوبات في تحليلاتها مجهرية باستخدام مجهر ابيفلوريسسينسي. القرار فائقة ثلاثي الأبعاد “المركبة إضاءة مجهرية” (3D-سيم) أداة واعدة للتغلب على هذه العقبة، وتكشف عن تفاصيل الجزيئية لعملية إنبات أبواغ عصيات نجحت (نجحت باء). هنا، يمكننا وصف استخدام سيمتشيك المعدلة (إيماجيج)-مساعد عملية التصوير ثلاثي الأبعاد والبروتينات الفلورية مراسل مجهرية سيم من جيرمينوسوميس جراثيم نجحت ، cluster(s) من البروتينات الإنبات. ونقدم أيضا إجراء تصوير سيم 3D (قياسية) لتلطيخ FM4-64 باء-نجحت بوغ الأغشية. باستخدام هذه الإجراءات، ونحن الحصول على قرار غير مسبوقة للتعريب جيرمينوسومي وتبين أن > 80% KGB80 باء-نجحت جراثيم نائمة تم الحصول عليها بعد تبوغ على المعرفة المتوسطة والمماسح الحد الأدنى لها واحد أو اثنين من غيرد-التجارة والنقل وجيركب-مشري البؤر. كما كانت البؤر مشرقة الملاحظة في FM4-64 الملون سيم 3D صور جراثيم مما يوحي بوجود مجالات الدهن الغشاء الداخلي لسيولة مختلفة يحتمل. مزيد من الدراسات أن استخدام مزدوج وسم الإجراءات مع الأصباغ الغشاء وجيرمينوسومي البروتينات مراسل لتقييم التعريب المشارك وهكذا الحصول على لمحة أمثل المنظمة عصيات إنبات البروتينات في الغشاء الداخلي بوغ ممكن.
Introduction
جراثيم بأوامر باسيلاليس وكلوستريدياليس أيضي نائمة ومقاومة غير عادية لأنظمة تطهير قاسية، ولكن إلا إذا كانت تنبت، لا يمكن أن يسبب آثار ضارة بالبشر1. في المغذيات جيرمينانت المشغلة إنبات أبواغ عصيات نجحت (باء-نجحت)، الحدث بدء جيرمينانت ملزم لمستقبلات جيرمينانت (الموارد الوراثية) الموجود في الغشاء الداخلي بوغ (IM). وفي وقت لاحق، ترانسدوسي الموارد الوراثية إشارات للبروتين قناة سبوفا الموجود أيضا في الدردشة. وهذا يؤدي في بداية تبادل بوغ الأساسية حمض بيريدين-2, 6-ديكاربوكسيليك (حمض ديبيكولينيك؛ اتفاق دارفور للسلام؛ تضم 20 في المائة من بوغ الأساسية بالوزن الجاف) للمياه عن طريق قناة سبوفا. في وقت لاحق، الإفراج عن اتفاق دارفور للسلام يطلق تنشيط التحلل peptidoglycan اللحاء، وامتصاص كميات إضافية من الماء يتبع2،،من34. هذه الأحداث التي تؤدي إلى الإجهاد الميكانيكي على طبقات معطف، انفصامه اللاحقة، وظهور ثمرة، وأخيراً النمو الخضري. ومع ذلك، لا تزال بعيدة عن تحل التفاصيل الدقيقة الجزيئية لعملية الإنبات.
مسألة رئيسية حول إنبات بوغ تتعلق بالخصائص الفيزيائية الحيوية من الدهون المحيطة بالبروتينات إنبات الدردشة فضلا عن البروتينات قناة “الدردشة سبوفا”. هذا بلير الدهن إيم غير متحرك إلى حد كبير هو الحاجز الرئيسي النفاذية للعديد من الجزيئات الصغيرة، بما في ذلك المواد الحافظة الكيميائية السامة، التي تمارس عملها في بوغ النواة أو الخلية النباتي السيتوبلازم5،6. Bilayer الدهن إيم من المرجح في حالة جل، على الرغم من أن هناك جزءا كبيرا من الدهون المتنقلة في التراسل الفوري5. وقد إيم بوغ أيضا إمكانات التوسع الكبير5. وبالتالي، يزيد من المساحة السطحية للدردشة 1.6-fold عند الإنبات دون تركيب غشاء إضافية ومصحوبا بفقدان هذا الغشاء مميزة منخفضة النفاذية والدهن الجمود5،6.
بينما التفاصيل الجزيئية تنشيط إنبات البروتينات وتنظيم الدهون إيم في جراثيم مواضيع جذابة للدراسة، صغر حجم الجراثيم ب-نجحت ووفرة منخفضة نسبيا من البروتينات الإنبات، تشكل تحديا أن التحليل المجهري. استخدام الصحفيين الفلورسنت تنصهر فيها البروتينات الإنبات، تقترح غريفيث et al ابيفلوريسسينسي المجهر أدلة دامغة، في جراثيم نجحت بروتين سقالة غيرد تنظم ثلاث مفارز غرام (ألف وباء وجيم) لغيرا وب ك الموارد الوراثية، في مجموعة7. مصطلح ‘جيرمينوسومي’ لهذه المجموعة من البروتينات الإنبات ووصفها الهياكل ~ 300 نانومتر كبير إيم البروتين البؤر8. عند بدء الإنبات بوغ، تفريق جيرمينوسومي نيون البؤر في نهاية المطاف تغيير إلى أكبر أنماط نيون، مع > 75% سكان بوغ عرض هذا النمط في جراثيم نامي على ح 1 مع لفالين8. لاحظ أن متوسط الورقة المذكورة أعلاه يستخدم الصور من عشرات الصور الفلورسنت على التوالي، للحصول على قوة إحصائية والتغلب على عقبة إشارات الفلورية منخفضة ولاحظ أثناء التصوير. لم هذا التصور لهذه الهياكل في الجراثيم البكتيرية على حافة ما هو ممكن من الناحية التقنية مع أدوات مجهرية الكلاسيكية ولا تقييم لمقدار البؤر في بوغ واحد لم يكن التعريب سوبسيلولار بهم أكثر تفصيلاً ممكن مع هذا النهج.
هنا، نحن توضح استخدام الإضاءة تنظيماً من (SIM) للحصول على مجموعة مرئيات تفصيلية مجهرية والتحديد الكمي ل germinosome(s) في جراثيم نجحت باء، فضلا عن تلك المجالات الدهن إيم9. ويتضمن البروتوكول أيضا تعليمات تبوغ وإعداد الشرائح وتحليل الصور التي سيمتشيك (v1.0، البرنامج المساعد إيماجيج) فضلا عن10،إيماجيج،من1112.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويتضمن البروتوكول عرضت إجراء سيم 3D قياسية لتحليل الملون جراثيم نجحت 64 FM4 يتضمن تبوغ وإعداد الشرائح وعمليات التصوير. وبالإضافة إلى ذلك، وصف البروتوكول تعديل سيمتشيك (إيماجيج)-ساعدت 3D التصوير عملية مجهرية سيم من جيرمينوسوميس بوغ نجحت المسمى مع الصحفيين الفلورسنت. الإجراء الأخير ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون كريستيان زيلينبيرج لمساعدته أثناء تصوير سيم. جي دبليو يقر “مجلس المنح الدراسية الصيني” لزمالة درجة دكتوراه وشكرا إيرين ستيلينجويرف لمساعدة لها المرحلة الأولية من التصوير.
Materials
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| Image J | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
References
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
- Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
- Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
- Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
- Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
- Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
- Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
- Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
- Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
- Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
- Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
- Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
- Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
- Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
- Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
- Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
- Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
- Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
- Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
- Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
- Swarge, B. N., et al. “One-Pot” sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).
